泛素交联酶RAD6在神经细胞退行性变过程中作用的研究

The accumulation of DNA damage closely related to neurodegeneration diseases. Defect of DNA damage response elements will cause neurodegeneration. We found that RAD6 accumulated to DNA damage site together with RNF168. Moreover, we find that ubiquitin BRCA1 and 53BP1 foci at DNA damage site decreased in RAD6 deficient cells. We reason that RAD6 participate the BRCA1 and 53BP1 pathway of DNA damage repair. In this study, we will further explore the function of RAD6 in this pathway, identify the functions of RAD6 in neuron during DNA damage response. We will further explore the role of RAD6 during neurodegeneration process through RAD6 knockout mice.

细胞和机体内DNA损伤的积累与神经退行性疾病相关，DNA损伤修复的缺陷会导致神经元的功能障碍和变性。我们在研究中发现了RAD6和RNF168作为相互作用的泛素交联酶和泛素连接酶共同定位于DNA损伤位点。更有趣的是我们发现了射线照射后RAD6基因缺失细胞内DNA损伤位点泛素化水平较正常细胞低，并且损伤位点BRCA1和53BP1的聚集减少，说明RAD6参与了DNA损伤修复反应BRCA1这条通路。同时我们也发现RAD6基因敲除小鼠出现了提前老化的现象，12月龄老年RAD6基因缺失小鼠学习记忆能力下降，海马区神经元数量较对照小鼠少，所以我们推测RAD6在神经退行性病变过程中发挥重要作用。在本项目中我们将沿着这一线索继续深入研究，明确这一对组合在DNA损伤修复过程中的作用。并进一步通过RAD6基因敲除小鼠探讨RAD6和RNF168一起在神经退行性病变过程中的作用。

细胞和机体内DNA损伤的积累与神经退行性疾病相关，DNA损伤修复的缺陷会导致神经元的功能障碍和变性。我们的前期工作证实了RAD6和RNF168作为相互作用的泛素交联酶和泛素连接酶共同定位于DNA损伤位点。更有趣的是我们发现了射线照射后RAD6基因缺失细胞内DNA损伤位点泛素化水平较正常细胞低。本研究以RAD6B缺陷的转基因小鼠和RPE1细胞为模型，首先探讨RAD6B在神经元DNA损伤修复通路中的作用及其上下游关系，发现在X射线照射后，RAD6B缺陷小鼠的神经元中53BP1和BRCA1聚集明显减少，说明RAD6参与了DNA损伤修复反应BRCA1这条通路。同时与WT小鼠相比，RAD6B基因敲除导致H2B泛素化显著减少。由于RAD6B-/-小鼠DNA DSBs修复缺陷，导致神经元基因组不稳定性增加，在此基础上我们用慢病毒（siNeg）转染小鼠海马神经元（RPE1）细胞，在X射线处理的情况下产生了大量的微核（MN）。我们发现RAD6B基因敲除小鼠出现了提前老化的现象。通过对RAD6B-/-小鼠神经元细胞核和神经元突起的银染色分析，RAD6B-/-小鼠的神经元染色更明显，X射线照射增加了部分核的染色，但大脑切片的变化表明，缺乏RAD6B会导致神经元数量减少，我们也在9个月大的RAD6B-/-小鼠的海马和齿状回中发现了大量嗜银颗粒(AGs)，这些结果进一步表明，RAD6B缺乏会加速神经元的衰老。进一步发现12月龄老年RAD6基因缺失小鼠学习记忆能力下降，海马区神经元数量较对照小鼠少，所以我们推测RAD6在神经退行性病变过程中发挥重要作用。通过回避实验和水迷宫来评估运动性能和学习记忆的差异。RAD6B神经元条件敲除小鼠表现为较不活跃，行为迟缓，运动能力下降，学习记忆能力低于WT小鼠。本研究不仅揭示了RAD6B参与DNA双链断裂修复以维持细胞基因组稳定性中的重要作用和机制，也为神经元衰老和神经退行性疾病的研究和治疗提供了新思路。研究过程中我们也发现了一些RNF8新的底物和新的泛素化修饰位点，为下一步研究确定了新的方向。基于本项目已标注发表SCI论文3篇,研究生毕业论文3篇。