牛乳铁蛋白及其活性多肽对犊牛小肠上皮屏障功能的作用研究

Lactoferrin and Lactoferricin have attracted considerable attention for their biological activities, such as broad-spectrum antimicrobial activity, antiviral activity, antioxidant activity, immune regulation and so on. Recently some studies found that the protective effects on epithelium cells of Bovine Lactoferrin and Lactoferricin. However, no research has reported on intestine epithelium barrier function of calf. In this study, we evaluated the ability of Bovine Lactoferrin and Lactoferricin in upregulating tight junction protein expression and improving the epithelial permeability of intestine epithelium cells of calf under normal condition and LPS stimulation, using transmission electron microscopy (TEM), Ussing Chamber and immunofluorescence. The selective MEK 1/2 and p38 inhibitors were applied in determining the signaling pathway, in order to induce diarrhea and improve growth of calf through nutritional control technology.

乳铁蛋白及其活性多肽因其具有多种生物学活性而引起广泛关注，近年来研究发现牛乳铁蛋白及其多肽对坏死性肠炎具有一定的治疗作用，并对肠道上皮细胞具有保护作用。但是，对犊牛小肠上皮屏障功能的作用未见报道。因此，本课题以犊牛小肠上皮细胞为研究对象，利用细菌脂多糖LPS建立犊牛小肠上皮细胞损伤模型，加入牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin, BLF）及其活性多肽（Bovine Lactoferricin, LfcinB），利用尤斯灌流室（Ussing Chamber）检测对营养物质吸收及上皮完整性的影响；利用电镜观察对细胞超微结构的影响；利用免疫荧光技术检测对紧密连接蛋白分布的影响；利用实时荧光定量PCR及western blot研究对犊牛肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响，并通过加入抑制剂探讨可能的信号通路。为通过营养手段减少腹泻，调控犊牛肠道健康，促进犊牛健康生长奠定一定的理论基础。

肠道上皮具有复杂的功能，既能在调控外源物质如细菌的侵袭中提供屏障作用，同时吸收营养物质。本研究以牛乳铁蛋白（Bovine Lactoferrin, BLF）及其活性多肽牛乳铁蛋白肽（Bovine Lactoferricin, LfcinB）为研究对象，利用大肠杆菌细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）建立了犊牛肠道上皮细胞损伤模型，利用形态学观察、细胞跨膜上皮电阻测定、免疫荧光等方法，研究了BLF及LfcinB对犊牛肠道上皮屏障功能的保护作用及其可能的机制。LPS刺激破坏了肠上皮细胞紧密连接结构，使得跨膜上皮电阻（trans-epithelia electrical resistance，TEER）显著降低，从而破坏了上皮屏障的完整性，。而BLF及LfcinB处理使紧密连接结构保持清晰完整，TEER与对照组相比差异不显著，提示BLF及LfcinB对LPS诱导破坏的肠道上皮屏障功能具有一定的保护作用。通过进一步机制研究表明，BLF及LfcinB能够提高紧密连接蛋白的表达，使由于LPS刺激导致的紧密连接蛋白在细胞边缘和细胞质分布和表达降低的情况恢复到对照组水平。并通过抑制剂研究提示BLF及LfcinB可能是通过MAPK信号转导通路促进细胞中紧密连接蛋白的表达，进而缓解由LPS刺激造成的破坏作用，保护肠道上皮屏障功能。上述研究为通过营养手段改善犊牛肠道免疫力、促进犊牛生长提供了一定的理论依据。