大豆凝集素对猪小肠上皮细胞屏障功能的影响及机制研究

This project is established in vitro pig small intestinal epithelium barrier model, in the soybean agglutinin treatmented, to checked TEER value,cross through the epithelial cells of the fluorescent marker protein, even and quantitative analysis of protein and mRNA expression, and closely connected to the cellular structure of the protein and the structure of the change rule, analysis to the rightness in vitro lectin soybean pig small intestinal epithelium barrier permeability model integrity and influence. And on this basis, observation soybean agglutinin and antagonist content (soybean agglutinin antibody or galactosamine, etc) under the condition of the coexistence of intestinal epithelium barrier integrity and permeability, the influence of the molecular understanding soybean lectin epithelial cells on the digestive tract of the barrier, which is helpful for the thorough discussion of soybean lectin nutrition mechanism, improve animals of soybean protein utilization ratio, and even the human food and animal feed safety to provide the theory basis and the safeguard.

本项目拟建立体外猪小肠上皮屏障模型，在大豆凝集素处理条件下，通过对跨上皮细胞电阻、荧光标记物通过率、紧密连蛋白基因和蛋白表达的定量测定，以及紧密连接蛋白的细胞结构及亚结构的变化规律，分析大豆凝集素对对体外猪小肠上皮屏障模型完整性和通透性影响。并在此基础上，观察大豆凝集素及其拮抗物（大豆凝集素抗体或半乳糖胺等）共存的条件下对肠上皮屏障完整性和通透性的影响，从分子水平上认识大豆凝集素对消化道上皮细胞屏障的关系，从而为深入探讨大豆凝集素抗营养机制，提高动物对大豆蛋白的利用率，乃至人类食品和动物饲料安全提供理论依据和保障。

大豆凝集素是大豆抗营养因子的主要成分之一。众多大豆抗营养因子中，大豆凝集素具有较高的稳定性，在很大的 pH 和温度范围内保持稳定，且不易被胃肠道内的蛋白酶降解，这种特性使其在大豆抗营养因子的抗营养作用中扮演了重要的角色，引起了学者们的普遍关注。此前有学者提出大豆凝集素的抗营养作用在于它与小肠上皮特异性受体或位点结合而导致的生理功能阻断和紊乱。.本项目将大豆凝集素与仔猪肠道上皮细胞的屏障功能联系起来，开展其对肠道上皮屏障功能影响的系列科学研究：大豆凝集素对猪小肠上皮屏障模型影响的研究；大豆凝集素对紧密连接蛋白表达的影响研究；拮抗物介导大豆凝集素对猪小肠上皮细胞屏障通透性的研究，试图描述大豆凝集素如何损伤猪肠道粘膜的机制。.研究结果表明：课题组成功构建了体外猪小肠上皮细胞（IPEC）屏障模型；大豆凝集素对猪小肠上皮细胞屏障功能影响研究表明，大豆凝集素能够增加仔猪小肠上皮细胞膜通透性，破坏小肠上皮细胞的完整性；大豆凝集素对紧密连接蛋白分布与表达量影响的研究发现，紧密连接occludin和claudin-3蛋白的相对表达量与对照组相比分别减少了31%和65%（P<0.05），大豆凝集素能够降低小肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达量，对增加小肠上皮细胞通透性和损伤其完整性提供了重要数据支持；拮抗物介导大豆凝集素对猪小肠上皮细胞屏障模型研究结果表明，课题组所筛选的N-乙酰基-D-半乳糖胺能够减缓或降低大豆凝集素致小肠上皮细胞的损伤作用，可作为大豆凝集素的拮抗物，能够显著改善大豆凝集素所致的肠道上皮膜通透性增加的作用，并提高细胞膜屏障蛋白的表达量，处理组细胞间紧密连接蛋白Occludin和Claudin-3的相对表达量分别降低了4.3%和7.2%（P<0.05）。通过筛选得到N-乙酰基-D-半乳糖胺降低大豆凝集素对仔猪肠道上皮细胞损伤作用的最优添加剂量和作用时间为0.5×10-4mmol/l，孵育4 h 。.项目将大豆凝集素抗营养机制研究与动物肠道上皮细胞屏障功能联系起来，利用大豆凝集素对上皮细胞屏障通透性变化，阐述大豆凝集素抗营养机制问题。从猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达变化规律，揭示大豆凝集素对上皮细胞屏障功能损伤的作用。在大豆凝集素拮抗物的介导下，研究大豆凝集素致上皮细胞屏障的损伤作用，为大豆凝集素对上皮细胞屏障损伤作机制研究提供参考数据。