基于G3DH酶定向进化的3-酮蔗糖类药物中间体生物合成研究

葡萄糖3-脱氢酶（G3DH）是一种新型的氧化还原酶，3-酮蔗糖是G3DH催化蔗糖的反应产物，含有一个用于选择性化学合成的羰基，在水相中，无需基团保护，能通过简单的化学反应合成具有高附加值的医药化工产品，如：有望开发成新型抗癌药物的稀有糖D-阿洛糖。本课题组利用项目主持人的前期研究成果，首先利用快速、高效的高通量筛选模型，筛选具有自主知识产权的G3DH高产菌株，建立微生物源G3DH库。然后利用酶基因克隆技术，构建G3DH酶的高效表达工程菌株，通过易错PCR技术定向进化G3DH酶，将大幅提高比酶活、改善酶学特性，解决G3DH应用的技术瓶颈问题。再利用进化酶生物催化与生物转化蔗糖制备3-酮蔗糖，实现3-酮蔗糖的高产率和高选择率。本研究旨在建立一个通过G3DH催化蔗糖合成3-酮蔗糖的新的途径和方法，为开发基于碳水化合物的医药化工产品打下基础。

葡萄糖3-脱氢酶是一种新型的氧化还原酶，其酶催化产物3-酮蔗糖及其衍生物可作为重要的药物中间体。G3DH的广泛用途引起了国内外学者的重视。但是目前存在着G3DH酶源稀少、酶活力不高等问题，限制了它的应用。针对这一问题，我们对G3DH的筛选、纯化、基因克隆等进行了深入的研究。首先，构建了一种基于底物特异性和比色法的G3DH高通量筛选模型。该模型以α-甲基-D-葡萄糖苷、半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖苷和3-O-甲基-D-葡萄糖苷作为筛选底物，以DCPIP为电子受体。以此模型，筛选到多株产G3DH微生物，其中菌株D6酶活力较高，鉴定为Sphingobacterium faecium ZJF-D6。其最佳产酶培养条件为：蔗糖为碳源，初始pH为7.0，25°C培养36 h。然后，对来自于S. faecium的G3DH分离纯化，得到了电泳纯的酶，分子量为66 KDa。研究了其酶学特性，最适pH为6.2左右，对热和酸碱敏感，具有广泛的底物作用范围，其活性受Hg2+离子完全抑制。再后，以纯化的酶液转化蔗糖，3-酮蔗糖的产率可达到28.7%。以静息细胞转化对硝基苯井冈霉，3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率达到90.3%。最后，利用基因挖掘从数据库中发现一种来自Glaciecola polaris的G3DH，其基因GpG3DH实现了在大肠杆菌中的表达。通过染色体步移获得S. maltophilia的SmG3DH的全长序列，其基因SmG3DH实现了在大肠杆菌中的表达。