野油菜黄单胞菌3-酮脂酰ACP合成酶III的生物学功能研究

Xanthomonas campestris pv. campestris is the causal agent of black rot of crucifers, which is a considerable challenge for the production of cruciferous vegetables. Fatty acid synthesis (FAS) is a primary bacterial metabolic pathway and hence is essential for survival of bacteria. Xcc has a complex fatty acid composition comprised of straight-chain saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, and branched-chain fatty acids (BCFA). BCFAs account for about 50% of the total fatty acid. Xcc also produces diffusible signal factor (DSF), which is a 2-enoic acids, as the quorum-sensing (QS) signal to communicate with each other to facilitate their adaptation to changing environmental conditions. However, up to date it is little known about the mechanism of BCFA synthesis and relationship between DSF biosynthesis and fatty acid synthesis pathway in Xcc. It has been demonstrated that bacteria FabH (3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III) catalyzes the key initiation step of bacteria fatty acid synthesis, which substrate specificity is a major determining factor for branched-chain fatty acids synthesis. In this proposal, we focus on Xcc FabH and set out to investigate three important and interesting questions: (1) to characterize the catalytic mechanism of FabH in fatty acid synthesis of Xcc; (2) to identify the function of FabH in DSF synthesis; (3) to investigate the mechanism of FabH in recycle of medium-chain acyl-CoAs. The goal of this project is to understand the biological function of Xcc FabH. It is expected that these research will provide some references for discovering new target to inhibit Xcc growth and developing novel biopesticides to effectively control black rot of crucifers.

十字花科黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病变种引起的，严重危害十字花科蔬菜的生产。脂肪酸合成是细菌的基础代谢之一，与细菌的生命活动密切相关。野油菜黄单胞菌含有大量的支链脂肪酸，另外作为该菌群体感应调控的信号分子DSF本身也是一种特殊的支链脂肪酸。然而到目前为止有关该菌支链脂肪酸的合成机制以及与DSF合成的关系仍不清楚。研究表明3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）的底物专一性决定着细菌能否合成支链脂肪酸。本项目围绕野油菜黄单胞菌的FabH，开展以下三方面的研究：（1）FabH在野油菜黄单胞菌脂肪酸合成中的功能及催化机制；（2） FabH与DSF信号合成的关系；（3）FabH在中链脂酰CoA再利用中的作用。研究目标是揭示野油菜黄单胞菌FabH的生物学功能，预期的成果有助于寻找防治黑腐病新的靶点，为进一步研发高效、特异的新一代绿色农药奠定基础。

野油菜黄单胞菌（Xcc）是十字花科植物黑腐病的病原菌，在世界范围内造成巨大的经济损失。Xcc在侵染寄主植物过程中需产生多种致病因子，而致病因子的产生受到由DSF信号介导的群体感应系统的严格调控，因此控制DSF合成是防控黑腐病的重要切入点。研究证明，DSF合成与脂肪酸合成紧密相关，但Xcc中脂肪酸合成机制还不清楚。.本项目利用异体遗传互补、体外活性分析和体内基因替换等方法，研究证明Xcc中FabH是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶，能利用支链氨基酸合同途径提供的支链脂酰CoA前体合成支链脂肪酸。利用大肠杆菌fabH替换XccfabH后，菌体不合成支链脂肪，也不合成具有支链结构的DSF，但能正常合成BDSF，而替换株的致病力也显著下降，证明XccfabH参加菌体致病性。.本项目研究证明Xcc中FabG1、FabG2和FabG3都具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，但FabG2只对中长链（≥C8）底物具有催化活性；而FabG1和FabG3能催化不同链长（C4-C12）底物，但FabG3活性仅有FabG1活性的10%-50%。fabG1是必需基因，只有过表达fabG2并且添加辛酸才能获得敲除突变株。但fabG2被敲除后不影响菌体的生长，但影响脂肪酸的组成。同时，fabG2突变株的DSF产量显著下降（< 50%），而过表达fabG1或fabG2也能显著提高DSF产量。XccfabG2的表达是生长时期依赖的，但不受到DSF信号调控，而下游蛋白Clp直接与fabG2启动子区结合，发挥负调控作用。FabG3是菌黄素合成中发挥独特作用的关键酶，但不参与脂肪酸合成。fabG3突变株对寄主植物的致病力显著下降，DSF信号分子产量显著下降，说明FabG3参与DSF信号分子合成。fabG3突变株菌黄素合成中断，可作为基因工程菌用于生产无色黄原胶。本项目还证明不同细菌中FabG同源蛋白具有功能多样性。