转录因子GbMYBF2与GbMYBF10对银杏类黄酮合成调控研究

转录因子的基因工程是植物次生代谢遗传改良的有效途径。前期工作中我们从银杏中获得2个可能参与类黄酮合成的转录因子基因GbMYBF2与GbMYBF10的cDNA片段。本研究拟采用RACE技术克隆银杏GbMYBF2与GbMYBF10基因的全长序列，利用Real-time PCR分析GbMYBF2与GbMYBF10基因在银杏中的时空表达模式，同时利用HPLC技术检测类黄酮含量，研究这2个基因表达水平与类黄酮含量的相关关系；构建GbMYBF2和GbMYB10的正义和反义表达载体，通过农杆菌介导遗传转化，在银杏愈伤组织中进行过表达和抑制表达试验，分析GbMYBF2和GbMYB10基因对类黄酮含量及合成途径中相关酶基因转录水平的调控作用，为阐明银杏类黄酮合成及其调控提供理论模型；并进一步筛选类黄酮含量较高的转基因愈伤组织细胞系，为工业化生产银杏类黄酮及银杏分子育种提供种质材料来源。

类黄酮化合物是银杏次生代谢途径中一个重要的药用成分，其含量是评价银杏叶商品质量的重要标准。因此，利用基因工程技术提高银杏叶黄酮含量具有重要理论意义与实践价值。尽管前人已从银杏中分离到多个类黄酮合成代谢途径中的结构基因，但有关类黄酮代谢的转录因子目前鲜有研究。本项目以银杏叶为试材，克隆了参与类黄酮代谢的两个转录因子GbMYBF2和GbMYBF10，并研究了这两个基因的调控功能，为阐明银杏类黄酮代谢的遗传机制奠定了基础。主要研究成果如下：1. 克隆了银杏转录因子基因GbMYBF2的cDNA与基因组全长序列，氨基酸序列分析结果显示GbMYBF2属于MYB基因家族。生物信息学分析结果表明GbMYBF2与其它抑制类黄酮合成的MYB蛋白的聚为一类，组织表达模式结果显示GbMYBF2在银杏叶、果、根与茎中均能表达，并且在根中的表达量显著高于其它组织。在银杏叶生长期内，GbMYBF2基因的表达量与类黄酮含量呈显著性负相关关系。转基因结果显示过表达GbMYBF2基因的拟南芥植株类黄酮与花青素含量显著低于非转基因对照植株。同时，在过表达GbMYBF2基因拟南芥植株中类黄酮合成相关的结构基因表达量也显著低于对照。上述结果表明GbMYBF2在类黄酮合成代谢中发挥了重要的调控功能，可能是类黄酮合成途径中一个重要的负调节转录因子。2. 利用RACE-PCR技术克隆到银杏的一个MYB转录因子GbMYBF10基因的cDNA全长序列。氨基酸序列分析结果表明GbMYBF10在N末端包含典型的R2R3保守区域，与其他植物MYB转录因子尤其是类黄酮合成相关的转录因子具有高度的同源性。基因进化树结果也表明GbMYBF10与其它类黄酮相关的MYB转录因子聚为一大类，并且与MYB10类转录因子亲缘关系最近，暗示了银杏GbMYB10蛋白可能与其他植物中MYB10转录因子相似，在银杏类黄酮合成途径中起着重要的调节功能。瞬时表达结果证实了GbMYBF10蛋白定位于细胞核中。转基因结果显示GbMYBF10过表达银杏愈伤组织中的类黄酮含量显著高于非转基因愈伤组织。实时定量PCR结果表明GbMYBF10基因过表达对类黄酮合成途径中结构基因的表达均有不同程度的上调作用。上述结果预示了GbMYBF10基因具有激活类黄酮化合物合成代谢中关键酶基因表达的作用,从而促进银杏类黄酮的合成代谢。