两个WD40转录因子对银杏类黄酮生物合成调控的研究

In our previous work, We have isolated tow partial cDNA full lengthes of GbWD40-1 and GbWD40-2 genes from Ginkgo biloba, which two transcription factors are potentially involved in flavonoid biosynthesis pathway. The present research is to analyse the time and spatial expression profiles of these two genes by real-time PCR. In addition, We are going to determine the flavonoid content by HPLC method and reveal the correlative relation between the expression level of the two WD40 genes and flavonoid content. The EMSA and chromatin immunoprecipitation assay will be conducted for screening the target genes of the two WD40 transcription factors. Also, the combinational experiments of two yeast hybrid and Co-Immunoprecipitation will be carried out for isolation the interaction proteins of the two WD40 proteins. Furthermore, the sense and antisense plant expression vectors of the two WD40 genes will be constructed and be transferred into G. biloba calluses by Agrobacterium-mediated system. Afterwards, We will investigate the function of the two WD40 genes in regulating flavonoid biosynthesis and transcript level of related genes through overexpression and suppression experiments of the two WD40 genes in transgenic G. biloba callus lines. These results will provide theory model to unveil molecular regulation mechanism of flavonoid biosynthesis.

申请者前期利用cDNA-AFLP 结合RACE技术筛选出2 个参与调控银杏类黄酮合成的WD40类转录因子GbWD40-1 和GbWD40-2基因cDNA 全长。在此基础上，拟采用荧光定量PCR 技术与HPLC，分析叶片发育过程中这2个基因表达量与类黄酮含量变化的相互关系，并对其表达产物进行亚细胞定位分析；通过凝胶阻滞结合染色质免疫沉淀分析WD40与相关酶基因启动子结合的顺式元件特点，筛选WD40所调控的靶基因；利用酵母双杂交与免疫共沉淀分离验证与WD40的互作蛋白；进一步构建其正义与反义表达载体转化银杏愈伤组织，通过类黄酮含量、转录因子WD40基因以及相关结构基因表达谱分析，解析2个WD40的作用途径与调控网络，阐明WD40调控银杏类黄酮生物合成的分子机制。

本研究从银杏中克隆了WD40转录因子家族的重要成员，并对其进行了功能鉴定、表达分析、不同组织表达、亚细胞定位和转基因分析等。基本弄清楚WD40-1对黄酮合成的调控机理，阐明了WD40-1调控银杏类黄酮合成的分子机制。研究结果发表学术论文9篇，其中SCI检索论文5篇，完成了预期成果。具体内容如下：从银杏中克隆获得GbWD40-1 基因全长序列。分析发现 GbWD40-1 基因组序列无内含子，与cDNA序列一致。该基因包含一个1017 bp 的开放阅读框，编码339个氨基酸。信息学分析表明，GbWD40-1与其他植物的 WD40 蛋白高度同源，含有保守功能区域。通过染色体步移技术获得了 GbWD40-1的5'侧翼序列，此区域含有保守的 MYB、 MYC识别位点，以及响应莉酸甲酯、乙烯、低温等作用元件。GbWD40-1表达具有组织特异性，在叶、雄花和幼果中的表达量较高，在茎中的表达量较少，在根中几乎不表达。在不同生长时期GbWD40-1表达量与叶中类黄酮含量呈显著正相关，表明 GbWD40-1可能参与调控银杏叶黄酮含量的积累。亚细胞定位分析发现，GbWD40-1主要在细胞核内表达。GbWD40-1转基因烟草中类黄酮含量的 HPLC 分析结果显示，山奈酚类、槲皮素类物质含量分别是对照组的 1.35 倍、1.73 倍。采用 Real-time PCR 分析 GbWD40-1 和类黄酮、花青素合成代谢的关键酶基因的表达量，结果转基因烟草中 GbWD40-1与 NtANS、NtCHI、NtCHS等基因表达量均有显著提高，呈正相关。GbWD40-1 基因转入银杏愈伤中可以显著提高其类黄酮，特别是花青素的含量。这些表明，GbWD40-1 可能与类黄酮、花青素代谢途径的关键酶一起作用，参与调控类黄酮、花青素的积累。利用已构建的银杏叶转录组数据库，筛选到另外2个WD40基因，分别命名为GbWD40-2和GbWD40-3，其中GbWD40-2序列包含一段2313bp的开放阅读框，编码770Aa；GbWD40-3序列包含一段1605bp的开放阅读框，编码534Aa。银杏GbWD40-2和GbWD40-3编码蛋白序列均含有典型WD40重复基序。GbWD40-2蛋白与无油樟WD40相似性为49%，GbWD40-3蛋白序列与无油樟WD40相似性为78%。