银杏转录因子GbWRKY1调控萜内酯生物合成的分子机制

The terpene trilactones are unique constituents of Ginkgo biloba and have important medicinal value. In our previous work, a full-length cDNA of the transcription factor gene was isolated and designated as GbWRKY1. The resluts of transgene test and analysis of promoter transcript activity showed that GbWRKY1 might be potentially involved in the biosynthesis of terpene trilactones. On the basis of previous work, The present study intends to take G. biloba embryo as test materials, and confirm the regulatory effect of GbWRKY1 on terpene trilactone biosynthesis through constructing the sense and RNAi vecter and transfering into G. biloba callus. The methods of GFP transient expression, EMSA, and CHIP are going to be carried out for screening the regulatory target genes of GbWRKY1, and identifying the cis-elements of target gene promoters. In addition, the real-time PCR will be used to analyse the differential expression pattern of GbWRKY1 and target gene under exogenous hormone treatments. The results of gene expression pattern combining the changes in terpene trilactone content are to identify the regulatory target genes of GbWRKY1. At last, we would like to isolate and identify the interacting proteins of GbWRKY1 and investigate regulating fuction of interacting proteins in terpene trilactone biosynthesis. The results of this study will provide the theory basis and gene resource for improving the content of terpene trilactone by genetic engineering technology in G. biloba.

萜内酯是银杏中所独有的萜类化合物，具有重要的药用价值。在前期研究中，申请人从银杏中克隆到一个转录因子基因GbWRKY1，转化烟草功能验证与启动子转录活性分析结果表明GbWRKY1可能参与了调控银杏萜内酯的生物合成。在此基础上，本研究拟以银杏胚为试材，1.通过构建GbWRKY基因超表达和RNAi载体转化银杏愈伤，验证GbWRKY1对萜内酯合成的转录调控作用。2.运用GFP瞬时表达、EMSA、CHIP技术筛选GbWRKY1调控的靶基因，并鉴定靶基因启动子的顺式作用元件。3.利用实时定量PCR技术分析GbWRKY1基因与靶基因在外源激素处理下的差异表达模式，结合萜内酯含量变化进一步确认GbWRKY1调控的靶基因。4.运用酵母双杂交与BiFC技术分离鉴定GbWRKY1的互作蛋白，并通过转基因验证互作蛋白调控萜内酯合成的功能。本研究结果可为利用基因工程技术提高银杏萜内酯含量提供理论基础和基因资源。

银杏萜内酯具有重要的生理活性和药用价值，提高其含量已成为银杏研究的热点与重点。近年来研究发现，WRKY转录因子可以与植物萜类化合物合成途径中相关酶基因启动子结合，激活这些酶基因的表达，有效启动或关闭萜类化合物代谢流量，从而调节萜类化合物的形成。本项目从银杏转录组库中筛选出WRKY转录因子基因家族；通过分析银杏WRKY转录因子与萜内酯代谢途径中相关酶基因在各种逆境胁迫下表达水平的相关性，筛选出参与调控萜内酯代谢的候选WRKY转录组因子基因GbWRKY1，并对其进行了全长克隆和表达特性分析，研究了GbWRKY1调节萜内酯合成的分子机制；利用EMSA技术筛选到GbWRKY1调控的下游靶基因HMGR和MVD，并研究了GbHMGR和GbMVD启动子功能与GbWRKY1蛋白的结合活性，从分子水平上初步探明了GbWRKY1调控银杏萜内酯合成代谢的转录调控机制。在此基础之上，本项目克隆鉴定了与GbWRKY1调控其它几个与萜内酯合成相关的靶基因包括GbAACT、GbPMK、GbHMGS、GbMK，通过基因表达模式分析、酵母功能互补等手段验证上述关键基因调控萜内酯合成的功能。此外，本项目建立了银杏外植体诱导愈伤组织的组培体系，优化了生产萜内酯的银杏组培技术，为银杏萜内酯代谢途径中关键基因的遗传转化提供了重要的技术支撑。上述研究结果为我们深入探索银杏萜内酯合成代谢中的转录调控机制奠定了重要的理论基础，并为今后利用基因工程手段提高银杏萜内酯含量提供了技术支撑。项目研究成果获得省级科技进步奖二等奖1项，发表论文14篇，其中SCI检索12篇。通过项目实施培养博士研究生1名，硕士研究生2名。