家蚕微孢子虫BAR蛋白在寄生增殖中的作用研究

The BAR (Bin/amphiphysin/Rvs) domain superfamily proteins have emerged as sensors of membrane curvature，thereby playing important roles in a wide variety of cellular processes, such as organelle biogenesis, membrane trafficking, cell division, cell migration，secretion, and endocytosis. Microsporidia are unicellular eukaryote microbes leading an obligatory intracellular parasitism in invertebrates and vertebrates. We found a novel spore wall protein encoded BAR domain in microsporidia, Nosema bombycis. Sequence analysis suggested Nbbar share highest similarity with Gvp36 which involved in vesicular traffic and nutritional adaptation of Saccharomyces cerevisiae and homologous genes of Nbbar are in a widespread distribution among microsporidia. Furthermore, we show that expression of NbBAR-GFP fusion protein within yeast cells, directs GFP to the membrane of yeast. These findings suggest that NbBAR may serve as an import regulator of membrane remodeling to accomplish endocytosis in microsporidian. Our proposal focus on the NbBAR function study on three aspects as following: NbBAR subcellular localization、interaction protein identification and the roles in reproduction process, we try to elucidate the role of NbBAR in the infection process of microsporidia. As now no BAR protein of microsporidia was reported, our proposal is an original work. To carry out such a project is very helpful to discover the molecular mechanisms of parasitism process of microsporidia, which contribute to resolve the prevention and control of microsporidia.

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核病原微生物，其寄生增殖机制的研究仍是21世纪微孢子虫研究的重点。BAR蛋白（Bin/Aphiphysin/Rvs，简称BAR）为细胞膜的形状感受器，在膜弯曲过程中募集膜泡运输蛋白等以完成细胞膜的塑形、营养需求、细胞分裂和迁移等重要生理活动。我们在研究家蚕微孢子虫蛋白质组的过程中发现一个含有BAR结构域的蛋白NbBAR，在已报道的微孢子虫基因组中均有存在，且与酵母中参与营养获得相关蛋白Gvp36具有较高相似性。定位实验表明NbBAR可靶向酵母的细胞膜。为阐明NbBAR在寄生增殖过程中扮演的角色，本研究拟从NbBAR的表达特征、互作蛋白鉴定以及功能分析三方面切入并借助酵母回复突变等技术深入研究NbBAR蛋白如何通过维持膜形状介导胞吞胞吐作用，进而为孢子寄生增殖提供营养。本研究的开展对于推进微孢子虫寄生生物学的研究和解析微孢子虫的防控机理研究具有重要的意义。

微孢子虫(Microsporidia)是一种与真菌亲缘关系较近的、专性细胞内寄生的真核微生物，给人类造成重大的经济损失，甚至威胁人类的生命健康。BAR(Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域蛋白在膜结构形成、物质运输、胞吞胞吐、信号传导中起重要作用。本研究采用生物信息学的方法筛选出家蚕微孢子虫中编码 BAR 结构域的候选基因NbBAR，序列分析显示NbBAR的C端预测有BAR-2结构域，N端具有肝素结合基序；不具有信号肽，跨膜结构域和 GPI 锚定位点。二级结构预测显示NbBAR 仅由7个α螺旋组成，NbBAR的三级结构与人内吞蛋白 Endophilin A1的BAR结构域具有相似性。采用非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测rNbBAR蛋白。结果表明 rNbBAR重组蛋白能够形成二聚体。采用酵母双杂交的方法也验证了rNbBAR 蛋白之间能够聚合形成二聚体。rNbBAR蛋白与牛脑脂质体孵育后经检测发现，该蛋白具有与脂质体结合的特征，荧光显微镜观察可看到明显的管状结构。宿主细胞膜结合实验显示rNbBAR可以与家蚕胚胎细胞BmE 结合。免疫印迹及间接免疫荧光分析发现 NbBAR从裂殖子时期即定位于孢原质膜上，在母孢子、孢子母细胞和成熟孢子中定位于孢子外周。免疫胶体金透射电镜的进一步分析发现，NbBAR定位于成熟孢子的孢原质膜和外壁。采用酵母定位系统研究发现NbBAR在内质网合成后转运到酵母细胞膜。当诱导表达24h后，培养基中营养物质的减少和代谢产物的增加使 NbBAR在酵母细胞质中增加了类似细胞器的定位信号。运用酵母BAR结构域蛋白 Gvp36 敲除株的功能回复实验等对NbBAR的功能进行了研究。NbBAR转入酵母Gvp36△突变株后能够使其囊泡生成缺陷的表型回复正常, NbBAR对酵母细胞Gvp36△突变株在高盐、渗透压力环境的适应性中发挥了作用。免疫共沉淀差异带质谱鉴定得到其潜在的互作蛋白热激蛋白 Ssa1p 和 Ssb1、磷酸丙酮酸水合酶、乙醇脱氢酶及甘油醛-3-磷酸脱氢酶。本项目对家蚕微孢子虫 BAR 结构域蛋白深入系统的研究，为微孢子虫致病机制的研究提供新思路并最终为微孢子虫的药物防控提供重要的靶标，对于微孢子虫寄生增殖机制的研究具有重要的意义。