花生膜联蛋白基因家族的克隆及功能分析

Annexin, a kind of multifunctional water-soluble protein, participate in a number of physiological processes, such as membrane construction, cell wall synthesis, maturation and stress respond, signal transduction and fruit ripening and play key roles in cell elongation, differentiation, exocytosis and damage repair etc.In this study,Annexins gene family (Ahanns) from peanut will be cloned using homologous cloning, RACE and TAIL-PCR technology combined with bioinformatics method, and their expression pattern will be defined under a series of stress treatment via Real-time PCR, and so are their tissue-specific expression patterns. By the construction of eukaryotic expression vectors of each gene and transformation of Arabidopsis or tobacco, gene function will be verified using pure transgenic strain. Key signal substance in Peanut stress-response will be found and gene function and mechanism will be dissected according to the results of structure analysis, function verification and the signal-transduction pathway research of Ahanns. Cloning and functional verification of Ahanns will supply significant gene resources for the study of Peanut stress resistance and molecular breeding programe.

膜联蛋白（Annexin）是一类水溶性的多功能蛋白，参与膜结构建成、细胞壁生成、生物非生物胁迫响应、细胞信号转导以及果实成熟等生理过程，对细胞生长、分化、分泌以及损伤修复等具有非常重要的作用。本研究利用同源克隆法，RACE和TAIL-PCR等技术结合生物信息学手段，对花生中Annexins基因家族(Ahanns)进行克隆；明确花生Annexins基因家族各个成员在不同逆境胁迫下的表达模式，同时进行基因的组织特异性表达分析；构建基因成员的真核表达载体，采用农杆菌介导法转化拟南芥或烟草，进行基因功能验证；寻找Ahanns基因介导的抗逆反应中的关键信号分子，结合Ahanns基因的结构分析、功能验证和信号转导途径的研究结果，解析膜联蛋白基因在花生抗逆中的作用机制。花生膜联蛋白基因家族的克隆及功能验证将为花生抗逆研究分子育种提供重要基因资源。

膜联蛋白（Annexin）是一类依赖Ca2+或者磷脂结合的多功能蛋白，在生物体内通常以多基因家族形式存在。高等植物膜联蛋白广泛分布在植物生长和发育的各个组织，参与多种生理进程，如膜建成、细胞生长、豆科作物的根瘤形成以及果实成熟等。许多研究已表明膜联蛋白在细胞信号转导、维持膜结构稳定性、细胞分泌过程以及植物响应逆境中起着重要作用。基于膜联蛋白的功能，本课题利用同源克隆法，从抗逆、广适花生品种冀花2号叶片中分离了膜联蛋白基因AnnAhs，获得花生中6个不同全长和2个部分序列的新膜联蛋白基因AnnAhs，命名为AnnAh1，AnnAh2，AnnAh3，AnnAh5，AnnAh6，AnnAh7，AnnAh4和AnnAh8（基因登录号分别为KM267643，KM276779，KM276780，KM276781，KM276782，KM276783，KM276784和KM276785），并对各成员进行了序列分析；进而扩增到AnnAhs基因组序列和启动子区域。利用荧光实时定量分析了不同处理及不同组织中AnnAhs的表达特性，6个AnnAhs均为组成型表达基因。花生中AnnAhs基因的转录水平响应干旱、盐、重金属、低温以及外源激素处理的调节，推测AnnAhs基因在花生抗逆调控中起着一定的作用。通过构建AnnAhs基因过表达载体pBI121-AnnAhs，以农杆菌介导转化烟草，筛选转基因阳性材料并对其功能进行了初步验证，转AnnAh1 T1代烟草能够提高转基因烟草在干旱和盐胁迫下的抗性；转AnnAh3 T1代烟草能够提高转基因烟草在干旱胁迫下的抗性，但对盐胁迫表现出一定的敏感；获得稳定了表达的T3代阳性植株及进一步的功能分析工作正在进行中。本研究为探讨膜联蛋白基因在抗逆中的作用机制奠定了坚实的工作基础，同时为探索家族成员间的关系提供了重要参考。