油菜菌核病抗病基因PGIPs家族的克隆及功能分析

Sclerotinia is the main disease of rape. Genes involved in defending Sclerotinia sclerotinia have not been found in rape and some other related plants so far. Some researches revealed that PG protein from sclerotinia sclerotiorum is the key pathogenic factor. PGIP protein exists in some plants is proved as an inhibiting factor targeted to PG protein and induce the defense reaction ability of plants. The research about defense reaction mechanism of PGIP protein has become the focus right now. This study is to clone all the 17 PGIP genes reported in Brassica Napus L. from resistive and susceptive rape material respectively, using homologous sequence method. Then check out the BnPGIP gene's SNP sites between resistive and susceptive rape material through DNA blast. We want to use fluorescence quantitative PCR to analyse the expression profile of 17 PGIP genes and select the candidate genes which may have function in defending sclerotinia. Then we clone the candidate genes' full length of cDNA from resistive rape and construct the overexpress vector, then express the PGIP genes in Arabidopsis and susceptive rape to confirm the function of candidate genes through transgenic technology. This study not only provides the theory basis for the research on revealing the resistant mechanism and function of rape endogenous BnPGIP genes, but also leads to a new approach to improve the resistant ability of rape and promote the sclerotinia resistance breeding.

菌核病是油菜的主要病害，到目前为止尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。油菜等植物中的PGIP蛋白对核盘菌的致病因子PG具有诱导性防卫反应作用，有关PGIP蛋白的防卫反应机制的研究已成为热点。本研究应用同源序列法，分别从甘蓝型油菜抗、感病材料中克隆全部17个已报道的BnPGIP基因，在DNA水平上比对分析抗、感病材料中BnPGIP基因的SNP位点差异；利用荧光定量RT-PCR筛选与抗性相关的候选BnPGIP基因，并对候选基因进行克隆，应用转基因技术对克隆的PGIP基因进行功能分析。研究结果能为揭示油菜中内源BnPGIP基因的抗病机制和功能提供理论基础，同时也为通过基因工程技术应用内源BnPGIP基因提高油菜的抗菌核病能力，为油菜及相关植物抗菌核病育种开辟新的途径。

菌核病是甘蓝型油菜的主要病害，它严重影响着油菜的产量和品质，尤其是“双低”油菜品种，由于降低了硫苷（一种十字花科植物体内先天存在的抗真菌物质）的含量使其更易感染真菌病害。研究表明，PG酶（多聚半乳糖醛酸酶）是病原真菌重要的致病因子，参与了植物多个致病信号传递过程，而植物中表达合成的PGIP（多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白）能特异的识别并结合病菌的PG酶，诱导植物的防御反应。据报道甘蓝型油菜中PGIP基因含有17个拷贝，其中部分BnPGIP基因能被核盘菌诱导表达，但有关BnPGIP与核盘菌的PG酶相互作用的机制还不清楚。因此，本项目开展了以下3方面的研究：第一，应用同源序列法，分别从甘蓝型油菜抗、感病材料中克隆全部17个已报道的BnPGIP基因家族，在DNA水平上比对分析两组BnPGIP基因的SNP位点差异，发现BnPGIP2基因在抗、感病品种间存在3个SNP位点并导致2个氨基酸位点突变。第二，转录组测序结果表明核盘菌在侵染油菜过程中主要表达SsPG1基因，而油菜中主要有4个BnPGIP基因的表达受到诱导，其中BnPGIP2基因的表达量最高；此外，宁RS-1在与核盘菌互作的过程中，与JA合成相关的AOS和LOX2基因表达量升高、而与SA合成相关的ICS1基因表达量降低；在JA信号传递过程中COI1和JAR1基因表达量降低，JAZ1基因表达量升高，从而导致PDF1.2表达量降低，说明JA信号通路被抑制；而在SA信号传递过程中，NPR1基因表达量降低，PR1基因的表达量升高，说明SA信号通路被激活，而且该过程并不依赖NPR1基因。第三，对BnPGIP1和BnPGIP2基因进行克隆构建过表达载体，并应用转基因技术进行转化，经抗性筛选和PCR检测，我们获得了4株转Npgip1基因、7株转Npgip2基因和13株转Wpgip2基因拟南芥以及11株转Npgip2基因油菜。通过本项目的实施，我们确定了两个与油菜抗菌核病相关的基因pgip1和pgip2；同时成功构建了相关基因的过表达载体，并通过农杆菌介导转化获得了转基因拟南芥与转基因油菜，为进一步解析pgip基因的作用机理奠定了基础。此外，信号传递途径基因表达谱的研究结果，为进一步研究核盘菌-油菜相互作用的机理开辟了新的方向。