中间锦鸡儿CdGAD家族基因克隆及抗逆功能分析

植物中谷氨酸脱羧酶（GAD）家族基因属于一很小的基因家族，对其在胁迫响应中作用的研究还处于积累阶段，而对其催化合成产物- - γ-氨基丁酸（GABA）的作用已得到广泛研究。本项目以沙漠灌木中间锦鸡儿（Caragana davazamcii）为材料，在对外源GABA调控盐胁迫响应和获得多条GAD序列的研究基础上，应用RACE技术克隆CdGAD基因家族成员全长cDNA；通过分析各成员对不同胁迫因子的表达差异，以及相应基因的拟南芥突变体对各胁迫因子敏感性的异同，推测该家族各成员可能对不同的逆境胁迫起着不同的作用。基于此，利用功能丧失突变体和过量表达株系来研究CdGAD家族各成员在应对不同逆境胁迫时的功能差异，以及在控制各自合成的内源GABA所调控的胁迫响应中所起作用的异同。最终揭示CdGAD家族各成员在多种胁迫共存的复杂沙漠生境中对中间锦鸡儿抗逆性状形成的贡献，为深入阐明中间锦鸡儿抗逆机制奠定基础。

植物中谷氨酸脱羧酶（GAD）家族基因属于一很小的基因家族，对其在胁迫响应中作用的研究还处于积累阶段，目前对其催化合成产物——γ-氨基丁酸（GABA）的作用在模式植物拟南芥中已得到广泛研究。之前我们以沙漠植物中间锦鸡儿为材料，应用SSH技术研究发现外源GABA能够调控基因表达，特别是与信号传导相关的H2O2和激素等相关基因（Plant Cell and Environment, 2010）。因此在此基础上，本项目以中间锦鸡儿为材料，结合模式植物如拟南芥和杨树等，在对外源GABA调控盐胁迫响应和获得多条GAD序列的研究基础上，应用RACE技术克隆CdGAD家族成员的全长基因CdGAD1、CdGAD4、CdGAD5；不同时空表达模式发现，这三个基因在不同组织中表达存在着明显差异，并且ABA、PEG和NaCl处理后也发现类似的结果，并且说明这些基因的表达与激素ABA有关，这为今后深入研究GABA信号与激素的关系提供了很好的初步证据；对同源的拟南芥突变体atgad1-5进行重金属和耐盐性等实验发现，14个纯合突变体系，atgad1-1和atgad2-3株系种子萌发及根生长对Cd胁迫和盐胁迫表现出敏感性。尤其是atgad2-3株系对盐胁迫响应，盐胁迫非常明显的抑制了种子萌发及根系生长，这说明AtGAD2可能在盐胁迫响应中占有非常重要的作用。并且，通过对GAD基因催化产物GABA的进一步研究发现，GABA能够调控盐胁迫下种子萌发期间的呼吸，低浓度下GABA抑制呼吸，但能促进H2O2的产生；蛋白质水平研究也显示相应的线粒体呼吸链复合物组分受GABA调控《Plant Physiology and Biochemistry, in revision》。在转录水平研究发现，盐胁迫早期胁迫响应的活性氧与激素相关基因的表达也能够受GABA调控，部分结果已投稿《Frontier in Plant Science》；并且发现GABA-支路相关基因的表达受ABA和NaCl的影响，部分结果发表在《PLoS One》。上述研究结果说明了GAD基因及其催化产物GABA与激素和活性氧存在着密切关系，进一步证明它们在胁迫响应中的作用。这为揭示CdGAD家族各成员在多种胁迫共存的复杂沙漠生境中对中间锦鸡儿抗逆性状形成的贡献，为今后深入阐明中间锦鸡儿抗逆机制奠定基础。