孕母雌激素对Fhl1基因敲除小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型的修饰作用及细胞骨架蛋白在此过程中的作用机制

Congenital clubfoot (CCF, MIM119800) is a congenital limb deformity, which is characterized by skeletal muscle abnormalities. Muscle abnormalities classified as congenital fiber type disproportion (slow fiber increase and fast fiber decrease), or additional muscle bundle in the gastrocnemius, have been found in many CCF cases, which may predict recurrent limb deformities. Our previous work showed that 17?-Estradiol (E2) regulated candidate gene for CCF-Fhl1 expression in L6GNR4 myoblast. So we speculated estrogen might be an important environmental factor in the pathogenesis of CCF. In the previous study we found myosin binding protein C was the downstream gene of E2 involved in the myoblast diffentiation. As the FHL1 cofactor, Gamma-actin, Non-Muscle Myosin IIB and myosin binding protein C were all cytoskeletal proteins. 17?-Estradiol and these protein play important roles in skeletal muscle cytoskeletal architecture, skeletal muscle development and skeletal muscle contraction function, but their functions in the fomation of CCF abnormal skeletal muscle phenotype are still not elucidated. So in this study we explore the influence of the estrogen level in the serum of pregnant mouse on the development and contraction function of skeletal muscle in the mouse with different genetic background (Fhl1-/- and wildtype). The role of estrogen level in the serum of pregnant mouse in the modification of abnormal skeletal muscle phenotype similar to CCF in Fhl1-/- mouse and the functions of Gamma-actin, Non-Muscle Myosin IIB and myosin binding protein C in this process are also considered. This study will provide the fundation for further understand the interaction of genetic (FHL1 gene) and environmental factors (estrogen level in the serum of pregnant mouse) in the pathogenesis of CCF.

先天性马蹄内翻足(Congenital clubfoot，CCF)是一种常见小儿先天畸形且患者下肢肌肉组织存在异常。雌激素可以调节成肌细胞中CCF关键致病基因-FHL1的表达,推测雌激素可能是CCF发病的重要环境因素。雌激素及前期筛选的雌激素下游基因myosin binding protein C和FHL1相互作用蛋白-Gamma-actin和Non-Muscle Myosin IIB(均为细胞骨架蛋白),在骨骼肌发育中发挥重要作用,但其在CCF肌肉表型形成中的作用尚不清楚。本课题研究孕母雌激素水平对不同遗传背景(Fhl1-/-和野生型)的胎鼠下肢骨骼肌发育和功能的影响, 探索雌激素水平对Fhl1-/-小鼠的类CCF肌肉表型的修饰作用及上述细胞骨架蛋白在此过程中的作用机制。通过本研究为理解遗传因素（Fhl1基因）和环境因素（雌激素）在CCF肌肉表型形成中的交互作用提供依据。

先天性马蹄内翻足(Congenital clubfoot，CCF, MIM119800)是一种常见小儿先天畸形且患者下肢肌肉组织存在异常。雌激素可以调节成肌细胞中CCF关键致病基因-FHL1的表达,推测雌激素可能是CCF发病的重要环境因素。在国家自然科学基金(81471466)的资助下，探索孕母雌激素水平对Fhl1-/-小鼠的类CCF肌肉表型的修饰作用及细胞骨架蛋白在此过程中的作用机制。主要的研究成果如下：(1) 证实了17-β雌二醇对C2C12成肌细胞分化的抑制作用。发现E2在向特异肌纤维分化方面的新作用，即促进Ⅰ型肌纤维的形成，抑制Ⅱ型肌纤维的形成。与普通分化培养基中的细胞比较，在用E2处理的C2C12细胞中鉴别出129个表达上调的基因和67个表达的下调基因。 (2)我们应用TALENs技术制作了Fhl1-/-基因敲除小鼠，发现Fhl1-/- 小鼠肌肉组织有肌萎缩、肌纤维类型改变和运动能力减弱等类先天性马蹄内翻足的表型。我们还利用透射电镜技术分析了6-9月龄的不同基因型小鼠胫骨前肌、胸骨舌骨肌和心肌的超微结构改变。结果发现：在Fhl1-/-小鼠的胫骨前肌、胸骨舌骨肌中有肌小节和肌浆网的排列紊乱，Z-盘结构模糊、自噬小体或自噬溶酶体样结构存在。Fhl1-/-小鼠肌肉组织中FOXO介导的自噬蛋白质降解系统异常激活可能和Ldb3、Mybpc2的表达失衡有关，进而导致Fhl1-/-小鼠肌肉萎缩、肌肉运动能力减弱等类CCF的症状。此外，Smyd1- H3K4me2修饰-P2rx7介导的细胞焦亡在Fhl1-/-小鼠骨骼肌类CCF表型形成中发挥重要作用。（3）我们探索了：孕期烟草烟雾暴露或者化学合成的雌激素暴露对不同遗传背景(Fhl1-/-和野生型)胎鼠下肢骨骼肌发育和功能的影响，结果发现: 两种类型的雌激素在孕期暴露后，均可以加重子代Fhl1-/-小鼠类CCF症状。FOXO1介导的自噬蛋白质降解系统异常激活，骨骼肌细胞骨架蛋白的异常表达（Mybpc2）和Smyd1- H3K4me2修饰-P2rx7介导的细胞焦亡的异常激活，在孕期烟草烟雾暴露加重子代Fhl1-/-小鼠类先天性马蹄内翻足骨骼肌表型中发挥重要作用。以上研究结果为我们继续探索环境雌激素以及烟草烟雾对骨骼肌发育的影响及先天性马蹄内翻足肌肉表型的形成机制提供了新的研究基础。