FHL1基因在先天性马蹄内翻足肌肉表型形成中的作用机制研究

先天性马蹄内翻足(Congenital clubfoot，CCF)是一种常见小儿先天畸形且患者下肢肌肉组织存在异常。在前期研究中，我们发现骨骼肌发育相关基因-FHL1是CCF重要的易感基因，但其引起CCF患者骨骼肌表型异常的机制尚不清楚。因此，本研究：（1）应用ChIP-seq技术筛选大鼠成肌细胞L6GNR4中Fhl1的靶基因。在细胞水平和体内(Fhl1敲除大鼠胚胎)观察Fhl1表达水平改变后对Fhl1靶基因表达的影响，进一步鉴定Fhl1对其下游基因的转录调控作用。（2）在细胞水平和体内(Fhl1敲除大鼠胚胎)观察Fhl1表达水平改变后对骨骼肌细胞的形态、增殖、凋亡、迁移和分化的影响及机制并比较Fhl1敲除大鼠的表型和CCF的异同点。通过本研究为深入理解Fhl1基因在胚胎骨骼肌发育中的作用及CCF患者肌肉异常发生的分子机制提供理论依据，为探索CCF畸形的预防和治疗措施提供前期基础。

先天性马蹄内翻足(Congenital clubfoot，CCF)是一种常见小儿先天畸形且患者下肢肌肉组织存在异常。在前期研究中，我们发现骨骼肌发育相关基因-FHL1是CCF重要的易感基因，但其引起CCF患者骨骼肌表型异常的机制尚不清楚。在青年基金(81100434)的资助下：（1） 我们发现Fhl1基因可能对喜树碱诱导的大鼠L6GNR4成肌细胞的凋亡没有影响。（2）我们分析了E16-E20天胚胎下肢骨骼肌中肌肉发育相关的关键基因的表达情况，我们发现E17天是下肢骨骼肌终末分化的关键时期。（3）FHL1可以作为co-factor和蛋白质相互作用发挥功能。我们应用免疫沉淀技术钓取了L6GNR4大鼠成肌细胞中Fhl1的相互作用蛋白，并通过质谱分析技术鉴定钓取的Fhl1的相互作用蛋白为Actg1和Myh10。我们进一步通过Co-免疫沉淀和免疫荧光技术证实了Fhl1/Actg1/Myh10复合体的存在。以上结果已经发表文章。（4）我们成功制作了Fhl1基因敲除小鼠，并且发现Fhl1基因敲除小鼠有类先天性马蹄内翻足肌肉表型，这为继续申请项目提供了有力的模式生物。（5）17β-雌二醇可以转录抑制大鼠成肌细胞L6GNR4中CCF致病关键基因-Fhl1基因的表达，并且前期实验结果表明17β-雌二醇可以抑制肌管的形成以及Ⅱ型骨骼肌纤维特异性MyHC4的表达。说明：雌激素17β-雌二醇可以调控下肢骨骼肌的分化，雌激素水平的改变有可能导致下肢骨骼肌出现肌肉无力、肌萎缩、肌纤维类型改变等症状。我们推测：雌激素水平是CCF发生重要的环境因素，孕母雌激素水平对Fhl1基因敲除小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型形成可能存在一定的修饰作用。因此，在此前期基础上，我们提出并获得了新的课题资助《孕母雌激素对Fhl1基因敲除小鼠类先天性马蹄内翻足肌肉表型的修饰作用及细胞骨架蛋白在此过程中的作用机制（81471466）》。