从抑制群体感应角度研究乳酸杆菌抑制单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制

Listeria monocytogenes cause listeriosis and the mortality rate of the listeriosis patients can be as high as 20-35%. L.monocytogenes form biofilm on biotic and abiotic surparces, so they can be resistant to antibiotics, antimicrobial drugs and sterilization. Due to its specific characterisitics, biofilm stay in the environment and cause food contamination and foodborne diseases, therefore it is a big potential problem in food industry.Quorum sensing (QS) has been reported to play an important role in regulating bacteria biofilm formation. With the increase of antibiotics resistance, targeting QS system of the pathogenic bacteria has been a new focus, which is called quorum quenching (QQ). Using natural antagonistic bacteria to QQ of the pathogenic bacteria has been reported. Previous study showed that Lactobacillus can inhibit L. monocytogenes growth and it was suggested that it can inhibit L.monocytogenes biofilm formation.This study aims at finding out whether Lactobacillus inhibits L. monocytogenes biofilm formation through inhibiting the QS system of L.monocytogenes and determining which pathway (luxS or agr) Lactobacillus is targeting to inhibit L. monocytogenes QS.First different Lactobacillus strains will be screened for 2 strains which can inhibit L.monocytogenes biofilm formation the most.Coculture Lactobacillus with L.monocytogenes and test if the transcritpion levels of luxS, agrD, prfA and inlA are affected due to the coculture. Construct mutants with the deletion of luxS or agrD and compare the biofilm formation of the mutants with the wild type when growing in the supernantant of Lactobacillus. The transcription levels of mutants prfA and inlA when coculturing with Lactobacillus are quantified to compare with the wild type.Test if the complementation of the mutants can restore the biofilm inhibition and transcripts level change. This study can provide a potential solution for controling L.monocytogenes as well as preventing biofilm formation in food industry.

单增李斯特菌形成生物被膜，由于生物被膜对杀菌剂等不敏感，易在食品生产流通环节中导致污染，对食品安全存在潜在威胁。细菌群体感应(quorum sensing,QS)对生物被膜形成起着重要的调控作用。近年来由于抗生素耐药性普遍出现，利用抑制细菌的QS来控制病原菌正逐渐成为世界研究热点，而国内在这方面的研究尚未见到报道。本项目旨在从对QS进行调控的角度来研究乳酸杆菌抑制单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制。筛选出一株对单增李斯特菌生物被膜形成抑制最强的乳酸杆菌，将其与单增李斯特菌共培养，比较单增李斯特菌的两个QS系统调节基因agrD和luxS及其他毒力基因转录水平变化。分别构建agrD和luxS的缺失株，比较缺失株与乳酸杆菌培养上清共培养时生物被膜形成的变化，以及毒力基因转录水平的变化。本项目将通过研究乳酸杆菌对单增李斯特菌QS抑制的分子机制，对控制病原细菌和生物被膜具有理论和实践意义。

单核增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的最佳生长温度为零下8℃到零上10℃，能够在冰箱或其他食品储藏条件下繁殖。由于单增李斯特菌生物被膜对杀菌剂等不敏感，能够在食品生产流通环节生长，从而对食品安全存在潜在威胁。细菌群体感应 (quorum sensing,QS) 对生物被膜形成起着重要的调控作用。近年来由于抗生素耐药性普遍出现，利用抑制细菌的QS来控制病原菌正逐渐成为世界研究热点，而国内在这方面的研究还不多见。单增李斯特菌存在两种QS 调控系统， LuxS 调控系统和Agr 调控系统。有研究报道表明luxS 和agrD 在单增李斯特菌生物被膜形成都有着调控作用。当单增李斯特菌QS 系统中的转录因子被激活后，会激活下游的毒力因子的转录和表达，如prfA和 inlA等。乳酸杆菌对于李斯特菌的抑菌作用虽早有报道，但主要报道都围绕在乳酸杆菌产生的菌素。.本研究对11株乳酸菌进行了筛选，发现4号（葡糖芽孢乳杆菌）和8号（莱氏曼氏乳杆菌）乳酸菌对单增李斯特菌的生长和生物被膜有最强的抑制作用，并进一步对其抑制的分子机制进行了研究。发现luxS和agrD基因的表达在与此2株乳酸菌共培养时都得到显著抑制(72h)，证明该 2株乳酸菌是通过对单增李斯特菌QS的抑制（quorum quenching）来对其生物被膜的形成进行抑制的。同时，我们也对单增李斯特菌毒力基因在与乳酸菌共培养时的转录水平进行检测，结果表明，共培养条件下，两个QS下游的毒力基因prfA和inlA都得到了抑制，进一步证明2株乳酸菌是通过对单增李斯特菌QS的抑制来对其生物被膜的形成进行抑制的。.本研究构建了单增李斯特菌luxS和agrD基因的缺失株。结果显示在缺失株与莱氏曼氏乳杆菌共培养的条件下，莱氏曼氏乳杆菌仍能够对luxS，agrD，prfA和inlA的转录水平进行一定程度的抑制。在葡糖芽孢乳杆菌和莱氏曼氏乳杆菌对李斯特菌缺失株的生物被膜抑制能力测试的实验中，葡糖芽孢乳杆菌和莱氏曼氏乳杆菌对李斯特菌缺失株的生物被膜能力有抑制作用。.本项目从乳酸菌控制单增李斯特菌QS 机制的来控制单增李斯特菌生物被膜形成的角度来阐述抑制致病菌生物被膜形成及毒力因子表达的分子机制，为减少食品行业中生物被膜可能造成的对人类健康以及经济损失方面的危害做好科研战略储备，同时也对控制病原细菌和生物被膜具有理论和实践