热应激下虹鳟mRNA差异表达及分子调控机理研究

Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss.) is a cold-water species of salmonid, which is cultivated as the main varieties in our country, but its poor resistance to heat seriously restricts the development of aquaculture. So far, the genes involved in heat-shock and their molecular regulation mechanisms still remain unclear in rainbow trout. This project will firstly launch studies on status of liver damage, blood cell apoptosis, serum immune and changes of metabolism parameters under varied temperatures by utilization of all-female full-sib fishes, and the "key high-temperature point" (HTP) indicates the significant changes of heat stress response (HSR) will be defined. Then the differential gene expression profiles of liver and kidney between 18℃ and HTP will be set up respectively through RNA-Seq base on the next-generation sequencing system of HiSeq 2500, and the protein-coding genes differentially expressed will be screened and will be entered into Gene Ontology (GO) and KEGG pathway analysis. Furthermore, the genes of expression differences more than 200 times between 18℃ and HTP will be verified through the Real-time quantitative PCR, and three to five important genes in key HSR pathway will further functionally analyzed by investigating their temporal and spatial expression patterns in six different tissues (blood，liver, kidney, brain, spleen and gills). These results will uncover the molecular mechanisms of HSR，and will contribute to the development of heat resistant breeding programs and heat resistant technology in rainbow trout.

虹鳟是我国主要的淡水冷水性养殖鱼类，但对高温耐受性差严重制约着其养殖业发展。目前，对应答虹鳟热应激的基因及其调控机理仍不清楚。项目以全雌虹鳟全同胞家系为材料，首先研究不同水温下虹鳟肝损伤、血细胞凋亡、血清免疫和代谢指标变化情况，评判不同水温下虹鳟的热应激反应（HSR）程度，确定HSR变化显著的"关键高温点"。然后基于高通量测序平台HiSeq 2500，进行RNA-Seq，构建虹鳟肝脏和肾脏"关键高温点"和最适水温（18℃）两组间差异基因表达谱，筛选出高温应激前后表达差异显著的蛋白编码基因，对其进行GO分析和KEGG通路分析，并对差异大于200倍的基因通过Real-time PCR进行验证，进而选择HSR关键信号通路上的核心基因3-5个，研究其在HSR过程中，在虹鳟6个组织（血液、肝、肾、脑、鳃和脾）中的时空表达差异，最终揭示虹鳟HSR分子调控机理，为虹鳟耐高温品种选育和抗热应激技术奠定基础。

本研究通过RNA-seq的方法对冷水性鱼类虹鳟受到热应激后肝脏和头肾组织的转录模式有了全面了解，系统筛选鉴定了与虹鳟热适应相关的基因，并对其调控途径进行了较为深入的阐释。具体如下：通过研究不同水温下虹鳟血液生化指标、肝脏损伤程度，确定24°C为虹鳟热应激反应的关键高温点，然后以18°C和24°C的肝脏和头肾为样品，分别建立了6个测序文库，通过测序在热激组与对照组中共获得27796个基因（mRNA），以q-value<0.05为临界阈值，共筛选出128个在热应激后表达差异显著的基因。多个参与温度调节的热休克蛋白基因如HSP47、HSP90、HSP70被鉴定，并发现了一些与热应激相关的新基因如CYPLA3、CCT3和PDIA3。GO和KEGG分析表明，多种生物学途径包括蛋白质代谢、能量代谢、免疫系统等参与热应激反应。内质网（ER）上的蛋白质加工是最重要和富集最显著的一个通路；ER相关的蛋白质降解（ERAD）和钙蛋白酶作为细胞凋亡的上游调节器在热应激时起关键作用。6个头肾测序后在热激组与对照组共获得40055个mRNA，以q-value<0.05为阈值，共筛选出443个差异表达基因，236个基因表达水平下调，207个基因上调，其中125个为新基因。这些差异基因包括HSP90、HSP70、HSP60和HSP40家族的一个或多个成员及一些辅助因子和协同伴侣。通过GO和KEGG分析对热应激时鱼类生理和基因通路进行深入分析，发现热应激条件下，涉及蛋白质折叠、未折叠蛋白结合和参与内稳态维持或适应性调节的多个生物学过程的基因被高度诱导；头肾中差异基因显著富集在4个通路上，包括“ER上的蛋白质加工”、“吞噬体通路”、“NLR信号通路”和“剪接体通路”。属于遗传信息加工的“ER上的蛋白质加工”通路是最富集的通路。内质网上的蛋白质依靠质量控制系统来确保未折叠或错误折叠的多肽被ERAD最终降解。“吞噬体”和“NLR信号通路”参与免疫系统的调控，通过免疫调控加强免疫、细胞凋亡和炎症反应，从而有助于细胞生存。RT-qPCR检验了部分基因的表达水平，验证了RNA-seq测序结果的可靠性。对热应激蛋白基因HSPA5、钙网蛋白基因CRT和蛋白质二硫化物异构酶A4基因PDILA4在6个组织、6个温度点的表达时空特征进行了分析，深入探讨了其在热应激过程中的功能和调控机制。