ROCK抑制剂调控人多能干细胞向功能性角膜内皮分化的实验研究

Corneal endothelial dysfunction could cause corneal edema and even vision loss.However, adult human corneal endothelial cells show limited proliferative capacity both in vivo and in vitro.Human pluripotent stem cells (hPSCs) have been confirmed as an ideal cell source of blinding diseases therapy. In our previous study, we found that hPSCs could be induced into functioinal corneal endothelial cells by ROCK inhibitor after treat with retinoid acid (RA). The differentiated cells with function of water pump in vivo showed similar morphology and typical gene expressions with human corneal endothelial cells. In this project, we will further examine the characteristics and functions of hPSC-derived corneal endothelial cells in vitro and in vivo, demonstrate the mechanism of ROCK inhibitor during the differentiation process of functional corneal endothelial cells. Our findings will not only reveal the molecular mechanisms of corneal endothelial differentiation, but also supply enough source cells for the clinical therapy of corneal endothelial dysfunction.

角膜内皮功能失代偿会导致角膜混浊和视力下降，而成人角膜内皮细胞增殖能力有限，因此，为解决这一难题需要寻找新的替代细胞来源。人多能干细胞是治疗致盲性眼病的理想种子细胞。我们发现，维甲酸（retinoid acid，RA）诱导后的人胚胎干细胞能够在ROCK抑制剂的调控下进一步分化为角膜内皮细胞，表达Na+-K+-ATPase，具有体内泵水功能，细胞形态和性质特征与人角膜内皮细胞相似。在此基础上，本课题拟进一步开展以下研究：（1）建立RA联合ROCK抑制剂诱导人多能干细胞定向分化为功能性角膜内皮细胞的实验体系，对分化角膜内皮细胞进行形态学、相关基因、蛋白表达及体内外功能鉴定；（2）检测抑制或激活Rho-ROCK信号通路时角膜内皮功能蛋白表达情况，探讨ROCK抑制剂在调控功能性角膜内皮细胞分化中的作用机制。为临床角膜内皮移植提供种子细胞来源，为角膜内皮功能失代偿的治疗提供新的思路和实验依据。

本课题计划通过建立体外分化体系诱导人多能干细胞干细胞向角膜内皮细胞分化，并体内验证分化细胞对角膜内皮功能失代偿的修复作用。在项目实施过程中，课题组按照项目计划建立了“两步法”hESCs定向分化为角膜内皮细胞的诱导体系。首先，利用RA和bFGF诱导hPSCs向神经嵴细胞分化，然后，利用ROCK抑制剂诱导神经嵴向角膜内皮细胞分化，并在体内外验证了分化细胞特异性蛋白的表达及安全性；利用兔角膜内皮功能失代偿模型，我们分别创新了“迷你植片移植”与“LN511预包被”的移植方法：前者通过选取适宜消化酶使分化细胞制成5~10个细胞的细胞团块进行移植，可以显著提高角膜透明速率；后者通过在移植前注射LN511改善损伤的后弹力层促进移植细胞的贴壁成熟，从而促进移植细胞发挥角膜修复功能。在此基础上，通过比较角膜内皮细胞和角膜内皮前体细胞的移植治疗效果，我们发现移植角膜内皮前体细胞可以短期内修复角膜功能，但是后期角膜复肿；NIC可以促进角膜内皮损伤修复，抑制内皮细胞EMT，将NIC联合内皮前体细胞移植，可以促进移植细胞的体内成熟与整合，从而实现角膜透明的长期维持；此外，NIC还可促进分化细胞的屏障功能完善。通过本项目的研究，课题组在Tissue engineering，Experimental eye research等SCI收录期刊发表标注本项目基金号论文4篇，取得授权专利3项。