瘦素促进人多能干细胞向造血干/祖细胞分化的作用及调控机制研究

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are capable of long-term proliferation and can differentiate into all three embryonic germ layers in vitro, providing a potential renewable source for generating transplantable HSCs and functional blood cells. However, the mechanism underlying human hematopoiesis remains largely unknown. In this study, by taking advantage of a monolayer-based hematopoietic differentiation model and the CRISPR/Cas9 technology, we try to investigate the regulatory role of leptin signaling during the hematopoieitc cell fate determination. Leptin or its receptor inhibitors will be added into the culture system at the different differentiation stage. The expression of marker genes and proteins at different hematopoietic differentiation stage with different treatment will be detected by using FACS, Western blot, immunofluroscence staining, and qPCR. The multilineage differentiation ability and haematopoietic engraftment in vivo will be detected by CFU forming experiment and murine myeloablative transplantation. The target genes regulated by Leptin and the activated signal pathway will also be investigated by using luciferase reporter system and CHIP assays. Together, the project will help us to understand the regulatory role of Leptin on hematopoietic differentiaon of hPSCs, and provide a promising avenue for clinical application involving hPSC.

多能干细胞（hPSC）具备高度自我更新能力和多向分化潜能，是研究胚胎造血发育的理想模型和制备大量血细胞的种子来源。本课题拟利用hPSC分化模型，阐明代谢调控分子瘦素（Leptin）在HSC分化中的作用及调控机制。在明确Leptin及其受体表达时序及空间定位的基础上，通过敲除hPSC中瘦素及其受体基因并结合外源添加Leptin或阻断剂，干预该信号在不同分化阶段的活化水平，通过基因表达、流式分析、集落形成及体内移植等实验分析诱导细胞的表型及功能，特别是对生血内皮细胞产生及生血内皮转换过程的影响。在此基础上，通过基因芯片分析结合荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀等分子生物学检测，进一步明确Leptin参与调控的关键信号通路及靶基因（群）。通过阐明Leptin在造血细胞分化发育中的作用，能更全面地了解定向造血发生的分化规律及调控机制，为寻找高效诱导hPSC向造血细胞分化的方案提供新的依据。

全球临床血液制品供应短缺已呈“常态化”趋势，寻找安全、充足的血细胞替代来源具有重要的社会意义和经济价值。利用人胚胎干细胞（hESC）体外诱导分化途径高效制备人工血液细胞，成为解决“血荒”难题的新策略。然而，目前对hESC向造血谱系分化命运调控的认识仍非常有限，导致现有的诱导方案制备效率低且分化细胞存在功能缺陷，极大限制了人工血液细胞制备技术的发展和转化应用。本课题重点研究一种脂代谢调节激素——瘦素（Leptin）在hESC向造血谱系分化的不同阶段所发挥的生理调控作用，并阐明该信号调控造血发生的分子机制。课题组在成功构建hESC规模化扩增和向造血干/祖细胞定向分化技术的基础上，检测了内源性Leptin及其受体基因在分化不同阶段的表达水平，初步明确该信号对生血内皮细胞形成及内皮-造血转换过程的关键调控作用。在此基础上，结合外源性重组因子添加及LepR+细胞分选策略，我们明确了活化Leptin信号能够显著提高分化细胞中造血和内皮关键转录因子的表达水平，并能够显著提高诱导第三阶段造血干/祖细胞（CD34+/CD45+）的分化效率，增强分化细胞的造血集落形成能力。我们结合信号通路阻断剂处理和分子生物学检测，发现Leptin能够对ERK蛋白进行磷酸化修饰并激活该信号通路，进而上调生血内皮细胞中造血关键转录因子RUNX1的表达水平，从而发挥其促进造血发生的调控作用。在此研究基础上，我们成功构建了一套非基质细胞/血清依赖的、成分明确的hESC向造血干/祖细胞和巨核系细胞的高效诱导分化方案，并证实基于Leptin添加的造血分化体系获得的巨核系细胞具有较好的生理功能。本研究将为后续深入探究Leptin是如何通过影响细胞代谢发挥对胚胎造血发育的调控作用，并构建具有完整生理功能的hESC来源多系人工血细胞奠定了工作基础。