PAX6基因与接触抑制信号通路调控内皮祖细胞向角膜内皮分化的研究

Corneal endothelial decompensation is a common but refractory disease in ophthalmology. Cornea allograft transplantation including endothelial keratoplasty has two limits, source of donor and immune rejection. Therefore, looking for a rich source of autologous pluripotent stem cell to replace the damaged corneal endothelium is the key to solve the problem. In our previous study, we found that endothelial progenitor cells (EPCs) induced by microenviroment in vitro and vivo can differentiate into corneal endothelial like cells and repair the corneal endothelium defect in animal models. But EPCs lost its stemness gradually during cell culture, the key genes in cell differentiation is unkown, the signaling pathway in cell differentiation is be to found. Aiming to solve these problems, our team intend to carry out the following research: application of 3D cell culture technology to maintain stemness of endothelial progenitor cells; up-regulation of PAX6 gene by CRISPR system to study its role in the process of cell differentiation; and then to study the mechanism of N-cad - p120 - RhoA contact inhibition related signaling pathway in EPCs’ differentiation. The success of the research will provide new theoretical and experimental support for the mechanism of multipotential stem cells differentiate into corneal endothelial cell. It is expected to achieve the really autologous stem cell transplantation in the treatment of corneal endothelial decompensation.

角膜内皮功能失代偿是眼科临床的常见病，却是难治性疾病。异体角膜移植（包括内皮移植）受到了供体来源和免疫排斥的两大限制，因此寻找自体来源丰富的多潜能干细胞替代损伤的角膜内皮细胞是解决问题的关键。我们在前期的研究中发现，通过体外和体内微环境的诱导，可将内皮祖细胞分化为角膜内皮样细胞并在动物模型中具有修复内皮层缺损的能力。但在细胞培养诱导过程中存在细胞干性丢失、诱导分化关键调控基因、调控分化的信号通路不明确等问题。针对这些问题，本课题拟进一步开展以下研究：应用3D培养技术维持自体来源骨髓内皮祖细胞干性；使用CRISPR技术上调内皮祖细胞PAX6基因的表达，研究其在诱导分化过程中的作用；以及N-cad—p120—RhoA接触抑制相关信号通路在诱导分化中的作用机制。研究的成功将为明确多潜能干细胞诱导分化为角膜内皮细胞的机制提供新的理论与实验支持，并最终有望真正实现自体干细胞移植治疗角膜内皮失代偿。

角膜内皮失代偿是常见角膜疾病之一，虽然可以使用角膜内皮层移植治疗，但国内角膜供体缺乏，使之成为临床治疗的难点。利用自体干细胞定向分化修复角膜内皮层是国内外研究的热点，但存在自身成体干细胞干性保持困难，定向诱导分化效果不明确等难点。课题组成员建立和完善了琼脂糖3D 成球培养体系，在体外培养中能有效促进内皮祖细胞的增殖，并能维持良好干性。在随后的研究中开展了不同PAX6基因导入体系的比较，发现腺病毒导入体系对内皮祖细胞诱导分化的效果较佳，并进行后续相关功能蛋白的检测，初步说明了PAX6 基因在内皮祖细胞内一定时间的高表达对诱导分化的作用。在此基础上初步探讨了N-cad—p120—RhoA 接触抑制相关通路在内皮祖细胞诱导分化为角膜内皮细胞中的作用机制，研究发现信号通路抑制剂Y27632对内皮祖细胞的形态变化及相关功能蛋白的表达都有促进作用。本课题的研究，对今后内皮祖细胞的在体外的大量扩增，以及后续向角膜内皮细胞的精准分化调控，提供实验基础。为今后角膜内皮失代偿提供临床治疗新思路和新方法。