融合蛋白GTH在大鼠精子转基因中的应用研究

本研究依据精子顶体表面存在大量促性腺激素释放激素受体的特点，构建表达了促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A转位肽-超嗜热古菌组蛋白融合蛋白，利用该蛋白结合精子、跨膜转运和携带DNA的特性，向精子内主动转运目的DNA， 前期研究结果表明融合蛋白确有DNA结合并主动向细胞和精子内转运DNA的能力，被转运的绿色荧光蛋白基因在Hela细胞内获得了荧光表达，通过免疫组化和PCR方法在被转染的精子内检测到HphA和目的基因，本项目作为30870348的延续课题，继续将含外源报告基因的真核表达载体高效主动地转运至实验大鼠精子内，经人工授精，子代动物通过表观、PCR、Northern印记和免疫组化筛选，获得绿色荧光性状的纯合子转基因动物。.本研究的意义在于尝试解决外源DNA进入精子内的瓶颈问题，为精子转基因技术探索一种有效解决途径，提供一种简单易行、高效的动物转基因方法，促进转基因技术和畜牧业的发展。

按照课题研究计划首先进行了融合蛋白GTH基因构建、表达与纯化；完成了融合蛋白GTH可溶性表达，工程菌发酵罐发酵，建立了简便高效的纯化工艺，获得了98%纯度的目的蛋白，通过正交实验确定了融合蛋白体外与DNA 结合的最佳结合条件并确定了融合蛋白质结合DNA的能力达到1：10，有力保障了课题的顺利实施。.大批量制备了抗HphA的单克隆抗体并建立了检测GTH的多种免疫学方法，包括ELISA、western blot和免疫组化等方法。建立了半定量RT-PCR和western blot方法用于检测细胞和精子中GnRH受体基因水平和蛋白质表达水平，筛选出了受体水平最高的细胞株进行DNA转运和绿色荧光测定。通过GTH重组蛋白作用于Hela细胞的免疫组化研究证明融合蛋白可以将超嗜热古菌组蛋白组分高效转运至细胞内。同时免疫组化实验还证明GTH融合蛋白可以将超嗜热古菌组蛋白组分转运至精子内，使精子细胞呈现的褐色阳性。利用GTH融合蛋白可以高效地将绿色荧光蛋白质粒转运至细胞和精子内，细胞在被作用12小时后50%以上细胞出现绿色荧光，且对细胞无任何损伤作用。GTH-DNA复合物转染精子的实验表明：融合蛋白显著提高了外源基因进入精子的效率。进行了多次SD大鼠转基因动物实验操作，但由于实验方法和操作技术不足，以及东北气候条件限制，母鼠未能人工授精成功，尚未获得阳性转基因动物，下一步将着力开展转基因动物的实验研究。.通过课题研究发表了1篇SCI论文：PLOS ONE2015.10（11）影响因子3.234，申报了一项发明专利；培养毕业了2名硕士研究生。