MBD1-siRNA逆转EMT的实验研究及对胰腺癌侵袭转移的影响

侵袭和转移是影响胰腺癌预后的重要因素，而EMT与胰腺癌的侵袭转移密切相关。本课题首先在TGF-β1体外诱导胰腺癌细胞BxPC-3发生EMT的过程中，动态监测EMT相关分子mRNA和蛋白的表达以及启动子区的甲基化程度，研究EMT发生的甲基化相关机制；然后以甲基化结合域蛋白MBD1为靶点，设计合成MBD1-siRNA，靶向抑制MBD1基因的表达，检测抑制前后EMT相关分子表达和启动子区甲基化程度的改变，分析MBD1-siRNA逆转EMT的机制；最后通过体内、体外实验，观察EMT发生及逆转对胰腺癌细胞侵袭性和转移能力的影响，较全面地认识MBD1作为甲基化调控新靶点在逆转EMT中的作用，为将来进行基因治疗胰腺癌侵袭转移、改善胰腺癌预后提供理论基础和实验依据。

我们的实验结果首先证实：MBD1在上皮型胰腺癌细胞株BxPC-3和SW1990中表达显著低于间质为主型的胰腺癌细胞株PANC-1与AsPC-1；同时，稳定敲除PANC-1内的MBD1基因，则间质标记分子N-cadherin 和Vimentin表达明显减少，上皮标记分子E-cadherin明显上调，而在SW1990中过表达MBD1，则显著上调间质分子Vimentin并下调E-cadherin。并且，原本具有间质型外观的胰腺癌细胞PANC-1在敲除MBD1后，细胞间变得融合成团，彼此之间连接紧密，形成类似上皮型外观。于是我们又进行了一系列体外细胞功能实验进一步证实：胰腺癌细胞内MBD1的表达与增殖、运动和侵袭能力成正相关，而抑制MBD1表达，则细胞增殖、侵袭和运动潜能明显受抑制。同时，针对敲除MBD1的胰腺癌细胞进行回补实验，则能恢复其对细胞体外增殖、侵袭和运动潜能的抑制效应。深入机制探索后我们发现MBD1与组蛋白去乙酰化酶SIRT1结合紧密，并且这一结合能够被经典转录抑制因子TWIST加强，ChIP和ReChIP实验进而证实，MBD1与SIRT1功能复合体正是通过结合E-cadherin启动子区域，使其启动子局部发生异染色质化（euchromatin）从而表观调控抑制了E-cadherin转录，说明了MBD1是通过与SIRT1结合后表观抑制E-cadherin的转录从而起到诱导EMT的状态，体外细胞实验与组织标本染色也进一步验证了这一机制，相关结果已成文并发表于Current Molecular Medicine杂志（IF=5.02）。同时我们通过相关药物试验发现MBD1与胰腺癌治疗抵抗密切相关，进一步实验又发现MBD1与DNA双链断裂的标志物γH2AX结合紧密，提示MBD1聚集于DNA损伤的区域。进而我们又发现，MBD1能够与在DNA损伤修复中起募集修复因子功能的关键分子MDC1结合，并聚集到受损伤的DNA位点而引起一些DNA损伤修复因子的表达变化。提示MBD1可能是通过促进胰腺癌细胞的损伤修复从而影响其放化疗抵抗的。相关结果已经成文，并已投送至International Journal of Oncology杂志（IF=2.3）。以上这些结果进一步证实了：MBD1在表观调控E-cadherin转录是胰腺癌细胞上皮间质化重要机制。