指导序列DNA修饰降低基因编辑的脱靶效应

CRISPR-mediated genome editing holds great potential to treat a variety of human diseases. However, a lot of challenges remain for its broad therapeutic applications. One key problem is the potential off-target activities. In our previous study, we demonstrated that partial replacement of RNA nucleotides with DNA nucleotides in the guide sequences of CRISPR system retain gene editing activity in human cells. Partial DNA replacement in the guide sequence significantly reduces off-target genome editing in human cells. Although it may provide a potential generalized strategy to reduce the off-target activities, in parallel improving the efficiency of on-target editing will allow its broader applications. Based on our previous results, we will further improve the chemical modifications of the guide sequences and sgRNA to realize the goal of both enhanced on-target and minimized off-target activities. We will increase purity of the synthetic sgRNA with reduced cost. Those sgRNAs will be delivered in vivo, and their off-target and on-target effects in tissues will be examined. The achievement of this project will well establish a strategy to reduce off-target activities, and its combination with non-viral in vivo delivery will move therapeutic genome editing one step further.

基于CRISPR系统的基因编辑在癌症、免疫和严重的遗传病等疾病治疗领域巨大的应用潜力，但目前基因编辑的应用仍有很多挑战，潜在的脱靶效应 (off-target activities)是其中关键问题之一。申请人前期研究发现，在指导序列（guide sequence）上使用DNA来替换部分RNA核苷酸，可以基本保持基因编辑的活性，并显著降低脱靶效应。提示通过DNA修饰可望解决降低脱靶效应的问题，但需要同时提高基因编辑的活性才能实现其更加广泛的应用。因此，本项目在前期基础上对指导序列和指导RNA（sgRNA）进行进一步的化学修饰，从而在减低脱靶效应的基础上保持并增强其基因编辑活力，提高合成纯度，降低成本，并在动物体内进行脱靶效应的检测。通过本项目的实施，为与非病毒载体介导的体内传输结合提供一个高效低脱靶的治疗平台，推动基因编辑在疾病治疗上的应用，具有重要的科学和应用价值。

CRISPR系统在疾病治疗领域巨大的应用潜力，但临床应用仍有很多挑战，潜在的脱靶效应 (off-target activities) 是其中关键问题之一。本项目开发精准编辑方案，其中一条技术路线是对指导RNA进行进一步化学修饰，降低脱靶。和在体编辑相结合，推动基因编辑在疾病治疗上的应用，具有重要的科学和应用价值。本项目完成每年的年度计划，获得了预期的研究结果，包括完成了多项实验平台建设，开发新的指导RNA合成方法，在实验动物在体编辑的验证，开发了新型的精准低脱靶的编辑系统等。在此项目的资助下，项目负责人以通讯作者发表论文 10篇，其中研究型论文6篇，包括 Nature Methods（2022）, Nature Biomedical Engineering （2020和2022），Nature Cell biology（2021）, Cell Discovery （2020）和 Cell Insight （2022），以及综述论文4篇。该项目的成果对CRISPR临床应用的脱靶问题提供了多种解决方案，对指导RNA的化学合成和化学修饰提供新型合成方法，有较好的科学价值。