基于硫修饰DNA特异性结合蛋白的新型基因编辑系统开发

Gene editing is the genetic engineering of insertion, deletion or replacement of DNA at a specific site in the genome of an organism or cell. Gene editing is becoming more and more important in scientific research and industrial applications, and researchers have worked tirelessly to develop novel tools. Gene editing is achieved by using engineered nucleases to create site-specific double strand breaks at desired locations in the genome. In this research, we plan to create new gene editing tools by using phosphorothioated oligonucleotides as guide DNA and fusion nuclease with sulfur binding domain to bind the guide DNA paired with genome, followed by cleavage made by the FokI cleavage domain. This tool do not require a PAM sequence for target cleavage, which enables it to target more sequences in the genome. Guide DNA may have a sequence length variation and longer guide DNA may reduce off-target frequency. This tool may also be used for other applications, such as for base editing by fusing the sulfur binding domain with cytidine deaminase, RNA editing by fusing the sulfur binding domain with adenosine deaminase acting on RNA, etc.

基因编辑能够精确的在活细胞内进行对特定DNA片段的敲除、插入等操作，具有重要的科学意义和产业价值，开发新型的基因编辑工具是当前的研究热点。基因编辑系统一般包含“定位”、“切割”和“修复”三个模块，定位模块负责识别并结合目标DNA区域，对基因编辑的效率和脱靶率都有重要影响；通过利用新型的定位模块，可以创造新型的基因编辑系统。本研究拟利用硫修饰DNA作为向导DNA，将其通过碱基序列匹配引入到基因组目标DNA中，然后通过硫修饰DNA特异性结合结构域SBD与含向导DNA的目标区域结合，并由融合的切割结构域FokI进行切割，从而造成目标DNA断裂并达到基因编辑的目的。本系统不受PAM序列限制，且使用较长向导DNA序列有降低脱靶率的可能性。本研究拟创新性的开发一种基于新型DNA定位模块的基因编辑系统，该模块还可应用于利用脱氨酶结构域进行单碱基编辑以及RNA编辑等，具有广泛前景。

DNA硫修饰是我国科学家的原创性成果，在前期研究中，我们发现了硫修饰DNA可以特异性的被修饰依赖型限制酶识别和切割。本项目在前期研究的基础上，基于硫修饰及其特异性识别蛋白SBD，开发了原创新型RNA编辑系统以及核酸检测技术。首先，我们通过发掘鉴定出序列识别范围宽泛的同源蛋白SBDHga，并利用结构生物学方法解析了SBDHga与硫修饰DNA复合物的晶体结构，揭示了SBDHga与其他SBD的不同之处在于其仅与DNA骨架发生相互作用，因此具有更加宽泛的序列识别范围。然后，我们开发了高分辨率鉴定SBD完整序列特异性的方法SBS-seq并对数种SBD进行了测定，并且，我们通过连续多个硫修饰的设计，进一步拓宽了SBD的序列识别范围并提升了结合力。通过基因发掘和鉴定，我们获得了无序列选择性而仅仅识别硫修饰且具有nM级别高结合力的SBD同源蛋白用于使能技术开发。我们通过将SBD与不同的效应器进行偶联，建立了基于硫修饰和SBD的新型RNA编辑系统和核酸检测技术。将SBD与RNA编辑器ADAR偶联，利用硫修饰的RNA探针与靶标区域通过碱基互补匹配相结合，然后由SBD结合硫修饰探针，从而将碱基编辑器ADAR靶向至目标位置，实现RNA的定点编辑，该编辑系统效率可达70%，与当前主流技术相当。将SBD与荧光双分子互补报告系统（Fluc-N和Fluc-C）偶联，利用双探针与靶标核酸的相邻位置结合，形成双硫修饰位点，由SBD对双硫修饰位点的结合促进Fluc-N和Fluc-C互补形成完整的荧光素酶，从而产生荧光信号，该核酸检测系统可在30分钟内实现检测，与变温扩增技术串联可以实现单分子检测，与等温扩增技术串联可以实现<1500 拷贝的灵敏度。