柔嫩艾美尔球虫组蛋白去乙酰化酶3的生化特性及其药靶有效性研究

Eimeria spp., the pathogen of the poultry coccidiosis, is an absolute intracellular protozoan parasite belonging to Apicomplexa phylum. Coccidiosis is the most important disease affecting the poultry industry worldwide and control of the disease is presently based on managerial skills and the use of prophylactic coccidiostatic drugs. With the emergence of drug resistant Eimeria strains, emphasis has been laid on development of new drugs. Eimeria spp. has a monoxenous life cycle in which there are complicated developmental stage conversions involving dramatic gene expression changes. Understanding the mechanism of causing these expression changes is the central topic in research and drug development. As well as other Apicomplexa parasite, such as Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum, Eimeria genome lack the coding sequence for DNA-binding transcription factors, in contrast, the genome possess lots of histone modification enzymes. This gene distribution bias implicate a epigenetic regulatory mechanism,which is charged for the regulation of gene expression and stage conversions. Histone deacetylase (HDAC) plays an important role in epigenetic regulations,in addition,the HDAC inhibitors are potent molecules for drug development. In this study, we will focus on the Eimeria tenella histone deacetylase3 (EtHDAC3). By investigating the expression pattern, subcellular location and enzyme activity, we will demonstrate the functions of the enzyme for E.tenella development. The composition of EtHDAC3 complex will be determined through co-immunoprecipitation and mass spectrometry, to demonstrate the molecular mechanism of EtHDAC3 in gene expression regulation. The repressive effect of HDAC inhibitors for E.tenella development will also be estimated, based on the in vitro culture system. These results represent a primary and significant step in interpretation of the epigenetic mechanisms underlying E.tenella development, and demonstrate the feasibility and potential power of HDAC inhibitors in control of coccidiosis.

艾美耳球虫是对养禽业具有巨大危害的一类寄生原虫，其生活史各发育阶段的功能基因表达存在明显差异，解析这些表达差异的调控机制，是深入理解球虫发育、球虫与宿主相互作用以及新药开发的理论基础。基因组数据分析表明，球虫基因组缺乏DNA结合的顺式转录因子，而富含组蛋白修饰等相关蛋白酶的编码基因，提示表观遗传调控机制可能是球虫基因表达调控的主要方式，其中组蛋白去乙酰化酶是重要的基因表达调控因子。本研究以柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶3（EtHDAC3）为研究对象，通过分析EtHDAC3的表达模式特征及酶活性的动力学，解析EtHDAC3功能复合体的组分，明确EtHDAC3调控基因表达的分子机理及其对球虫发育的作用。并通过HDAC抑制剂对EtHDAC3活性及球虫发育的影响，筛选在抗球虫药物上具有应用前景的EtHDAC3特效抑剂。研究结果有助于深入认识球虫基因表达调控的理论，对球虫病防治具有重要的理论意义。

艾美耳球虫是对养鸡业危害最大的病原体之一。随着鸡球虫抗药性的普遍产生，迫切需要寻找新的药物作用靶标分子，开发新型药物。球虫生活史各发育阶段的功能基因表达存在明显差异，解析这些表达差异的调控机制，是深入理解球虫发育、球虫与宿主相互作用以及新药开发的理论基础。基因组数据分析表明，表观遗传调控机制是球虫基因表达调控的主要方式，其中组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是重要的基因表达调控因子，是极具应用前景的药物靶标。本研究课题以柔嫩艾美耳球虫组蛋白去乙酰化酶3（EtHDAC3）为主要研究对象，拟通过分析EtHDAC3的表达模式特征及酶活性的动力学，为研制新型抗球虫药、新型疫苗奠定理论基础。本项目执行以来，取得的主要结果有以下几点。一，克隆得到了EtHDAC3基因cDNA全长并进行了原核表达；初步明确了EtHDAC3在球虫细胞发育不同阶段的表达量差异。二，克隆得到了球虫组蛋白去乙酰化酶EtSir2A基因cDNA序列全长，并进行原核表达；明确了EtSir2A在球虫细胞发育不同阶段的表达量差异；测定了EtSir2A酶活性，初步得到了EtSir2A的酶活动力学曲线以及抑制动力学曲线；使用ITC（等温滴定量热仪），测定了EtSir2A与其底物的亲和力，初步得到了其亲和力常数。为我们设计、筛选EtSir2A特异性抑制物，以及更进一步，为今后开发新型抗球虫药物奠定了基础。部分内容已经整理并发表于《畜牧与兽医》。三，克隆得到了球虫七条组蛋白cDNA序列，包括EtH2A、EtH2B、EtH3、EtH4、EtH2A.Z、EtH2Bv、EtH3v；建立了球虫组蛋白的提取方法，为进一步解析组蛋白不同变异体以及组蛋白修饰的动态变化在球虫细胞发育过程中的调控作用奠定了基础，是我们理解球虫发育的表观遗传调控的关键。四，利用定量PCR技术，对鸡感染球虫后131个免疫相关基因的表达量的动态变化进行了研究。结果显示，在感染后，鸡相关免疫基因的调控网络发生很大改变。相关结果有助于我们理解宿主与球虫的相互作用以及宿主的免疫调控机制，为进一步开发抗球虫疫苗以及防治技术提供了新的思路和理论基础。部分结果已整理成文并正在投稿。