多功效靶向重组益生素模式菌优化构建和深入研究

猪产肠毒素大肠杆菌（ETEC）粘附素受体结合域和粘附素操纵子编码基因已被鉴定，运用DNA重组技术将上述粘附素受体结合域和操纵子编码基因克隆入广谱性CRIM质粒（条件性复制、整合和调节性质粒），使之在λpir大肠杆菌工程菌中功能性表达粘附素或粘附素受体结合域，进一步在体外验证其与易感仔猪肠上皮细胞的结合、粘附特性。在此基础上，利用噬菌体位点特异性重组酶重组技术，将功能性表达粘附素的CRIM重组质粒整合到靶定的通用型载体益生素模式菌染色体特定噬菌体附着位点，使其成为单拷贝稳定性表达功能性粘附素/受体结合域整合体，进一步测试其在仔猪肠道上定居和有效持续表达粘附素性能，并与易感宿主肠上皮细胞的结合、粘附特性，优先封闭/阻止肠道上皮细胞受体与ETEC病原菌的结合。旨在优化构建遗传稳定、定植力强的多功效靶向重组益生菌，开辟出非抗生素治疗的、高效广谱的、直接全新的细菌性治疗策略和预防途径。

猪产肠毒素大肠杆菌ETECF18和K88菌毛完整黏附素操纵子编码基因在申请者实验室克隆和序列鉴定，进而靶向F18ab和K88ac优势血清型代表株的完整菌毛黏附素，运用DNA重组技术将上述两种菌毛操纵子编码基因分别克隆入广谱性CRIM质粒pCAH63（条件性复制、整合和调节性质粒），使之在CC118λpir工程菌中功能性表达F18和K88菌毛黏附素，同107/86和C83902亲本标准株一样，上述重组菌分别能与兔抗F18ab菌毛单因子血清和鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体产生明显的凝集反应，且在体外均能较好地黏附于易感仔猪小肠上皮细胞。基于噬菌体位点特异性重组酶重组技术原理，探索重组技术路线和建立整合条件参数，将功能性表达上述菌毛黏附素的CRIM重组质粒整合到靶定的益生素大肠杆菌Nissle1917染色体特定噬菌体附着位点，使其最终成为单拷贝稳定性表达功能性F18和K88菌毛黏附素的整合体，进一步测试验证其同样能与易感仔猪肠上皮细胞良好的结合、黏附性能。鉴于Nissle1917中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒和其质粒背景相对清晰的前提条件，引入自杀性载体并构建含上述待去除质粒的重组自杀质粒载体，利用质粒不相容性原理，去除菌内原有质粒并同步实施自杀质粒自身去除的特性，确保原有宿主菌内质粒完全去除，从而大大提高宿主菌Nissle1917的固有载荷能力而不影响其基因组和自身生物学特性性状，从而优化和简便Nissle1917染色体特定噬菌体附着位点整合技术条件、整合效率。因此，基于F18和K88操纵子基因稳定性整合在修饰完善的通用型载体模式菌Nissle1917中，能功能性表达菌毛黏附素并与易感宿主肠上皮细胞的结合、黏附特性，为遗传稳定、定植力强的多功效靶向重组益生菌。上述研究旨在靶向仔猪体内肠道上定居和有效持续表达黏附素，优先封闭和阻止肠道上皮细胞受体与ETEC病原菌的结合，开辟出非抗生素治疗、高效广谱、直接全新的细菌性治疗策略和预防途径。在平行试验中，将筛选标记gfp基因克隆入pCAH63中，筛选出用于整合的CRIM-gfp (p63GFP)质粒，通过λ噬菌体特异性整合位点将其整合入大肠杆菌工程菌SE5000基因组中。通过荧光显微镜可以检测到SE5000::p63GFP整合体中gfp基因的表达，为整合外源操纵子基因的表达和检测提供较为直观的筛选标记。