靶向探究K88产肠毒素大肠杆菌毒力相关因子

The classic pathology of ETEC involves fimbriae and enterotoxins as the bacterial virulence, while more recently it is demonstrated that fimbriae combined with heat-labile toxin, flagella and host cAMP are involved in the ETEC attachment, colonization and infection to the host intestinal epithelium. In fact, more data shows the dynamic process of interaction between ETEC virulence factors and host cells, which is related to the bacterial quorum sensing regulation. It would be true that identifying and charactering the virulence factors and cAMP-dependent attachment-based signaling pathway in K88+ ETEC is so important. Using the next generation sequencing combined with transcriptome and transposons screening technology, we will de novo sequence the genome of three serotypes of K88+ETEC, rapidly find out and confirm those unknown virulence factors, and screen high-affinity cAMP transporter genes involved. Meanwhile, targeting specific virulence related factor for further study, and figuring out the function of cAMP in QS mediated pathogen attachment and infection, in which way help well understand of the K88+ETEC molecular pathogenesis, and apply effective prevention and control to ETEC infection.

传统产肠毒素大肠杆菌（ETEC）病原（病理）学认为其毒力因子分为菌毛黏附素和肠毒素两部分，现已进一步认知菌毛、热敏毒素、鞭毛和宿主环磷腺苷酸（cAMP）共同介导ETEC病原对小肠上皮细胞黏附、定植和感染。事实上，不断进展数据表明ETEC通过多毒力因子与宿主细胞互作是动态过程，与细菌群体感应系统（QS）的调控密切相关，因此鉴定和特征K88+ ETEC兽医重要病原菌毒力因子和调控病原菌黏附定植的第二信使cAMP依赖的重要信号通路意义重大。利用下一代测序技术结合转录组、转座子筛选法，对K88+ ETEC三种血清型菌株遗传序列从头测序，旨在快速有效地挖掘未知、且能验证出相关毒力因子，筛选出高亲和力cAMP转运系统相关基因，同时靶向探究特定毒力相关因子，探析宿主cAMP在QS中介导病原菌在易感动物体内黏附定植、感染侵袭，进一步诠释K88＋ETEC的分子致病机制和提供有效防控ETEC感染策略。

K88+产肠毒素大肠杆菌是兽医临床上最常见的病原菌之一，由其引起的断奶仔猪腹泻是导致初生及断奶仔猪发病死亡的重要原因，也是造成全球养猪业经济损失的重要因素之一。K88+产肠毒素大肠杆菌的三种血清型中，由于K88ab/ac/ad三种血清型菌株在细胞上的黏附受体和受体结合域不尽相同，产生的临床症状也存在差异，因此三种血清型的产肠毒素大肠杆菌致病机制并不相同，提示在K88+产肠毒素大肠杆菌中还存在未知的毒力因子参与致病过程。本研究利用二代加三代高通量测序技术，成功获得K88+产肠毒素大肠杆菌国内参考株全基因组数据，并完成基因组信息注释工作。全面挖掘K88+产肠毒素大肠杆菌的基因组信息，发现HPI毒力岛、T6SS等基因簇；alpha菌毛、stf菌毛、sfm菌毛，LPF菌毛等在ETEC上未曾报道的候选新型毒力因子。进一步对HPI毒力岛、alpha菌毛、sfm菌毛、LPF菌毛等识别的新型毒力因子展开深入研究，发现K88+产肠毒素大肠杆菌中HPI参与sepA、ecpA、kpsD、cblB、stfG、ipfA、fliC等基因的表达调控，从而影响细菌毒力；alpha菌毛和LPF菌毛在K88+产肠毒素大肠杆菌中均能表达，LPF菌毛与细菌定植肠道细胞密切相关，而alpha菌毛和sfm菌毛在细菌致病中的作用有待未来进一步研究确认。转录组测序发现K88+ETEC中有173种sRNA表达，进而预测到有可能存在170503种sRNA 与mRNA互作的方式；其中，通过EMSA法验证确定sRNA00062在K88+产肠毒素大肠杆菌的致病过程中具有重要的毒力因子调控作用。本研究构建了cyaA基因缺失株筛选大肠杆菌高亲和力 cAMP 转运系统相关基因，初步获得了c-di-GMP的表达调控网络。鉴于细菌金属离子转运系统在细菌与宿主互作过程中的作用探索，本研究通过RNA-seq技术筛选出K88ac+ETEC低锌环境下主要的锌离子转运系统ZnuACB，构建了K88ac+ETECΔznuACB缺失株，通过体外试验证实ZnuACB系统是重要的毒力因子，也是细菌在低锌环境下维持毒力表型的重要系统。本研究旨在靶向挖掘K88+产肠毒素大肠杆菌中的新型毒力因子及其相关调控网络，为进一步明晰ETEC致病过程的分子机制奠定基础。