链置换PCR靶向富集技术和分子信标介导的高分辨熔解曲线在非小细胞肺癌循环肿瘤DNA液态活检中的应用探索

Detection of non-small cell lung cancer (NSCLC) ctDNA is important for tumor staging and targeted therapy. However, ctDNA content is extremely low and accompanied by a large number of dominant wild-type free DNA from normal cell. Therefore, the detection of NSCLC ctDNA needs to solve the following scientific problems: the interference of dominant wild-type free DNA to rare mutant ctDNA; accurate detection of ctDNA mutation sites. In order to solve the above problems: for the interference of dominant free DNA, we use strand displacement primer-mediated PCR to achieve background suppression of wild-type free DNA and efficient enrichment of rare ctDNA; for accurate mutation sites detection, molecular beacons mediated high-sesolution melting curve analysis are used and appropriate temperature interpretation rules are established to achieve accurate detection of the mutation sites, at the same time relative quantitative analysis of rare mutations are achieved. Exploring the the multiplex PCR-mediated multiplex PCR to reduce the complexity of the single-reaction system of multiple target genes, by the combination of molecular beacon-mediated melting curve to achieve accurate reading of the mutation site. The implementation of the project will provide a new technology platform for NSCLC rare mutation detection and clinical application, provide a basis for early diagnosis of tumors, and provide information guarantee for tumor staging, metastasis and targeted therapy.

非小细胞肺癌(NSCLC) ctDNA的检测对于肿瘤的分期和靶向治疗具有重要意义。然而，ctDNA含量极低且伴有大量正常细胞来源的优势野生型游离DNA。因此，NSCLC ctDNA的检测需要解决以下问题：优势野生型游离DNA对ctDNA的干扰；ctDNA突变位点的准确阅读。为了解决上述难题：针对优势游离DNA的干扰，我们利用链置换引物介导的PCR实现野生型游离DNA的背景压制和稀有ctDNA的有效富集；针对突变位点的准确阅读，采用分子信标介导的熔解曲线并建立合适的温度判读规则来实现突变位点的准确检测，并实现稀有突变的相对定量分析。探索链置换引物介导的多重PCR体系的复杂程度实现多个靶基因的单反应体系同时扩增，并结合分子信标介导的熔解曲线实现突变位点的准确阅读。该项目的实施将为NSCLC稀有变异检测和临床应用提供全新技术平台，为肿瘤早期诊断提供依据，为肿瘤分期、转移和靶向治疗提供信息保障。

单核苷酸变异(SNVs)的检测和多重PCR对精准医疗的实现具有重要的价值。临床上常用SNVs检测和多重PCR存在以下问题：难以提取具有杂交活性的高拷贝单链靶基因。CYP2C19*2中的单核苷酸变异与冠心病常用的药物氯吡格雷耐药性产生相关。为了指导药物使用剂量和开展个体化医疗，本文首次采用阻滞位移扩增技术特异性扩增G位点和A位点等位基因。在电化学分析策略中，采用具有电化学活性的亚甲蓝和二茂铁分别标记正向引物，对于G位点来说产生的信号位于-0.26V处，对于A位点来说产生的信号位于0.22V处。对于侧向层析流动条带试验，使用经过特定修饰的引物在G位点的测试线1和A位点的测试线2中产生独特的颜色。综上所述，我们开发了一种基于电化学传感器的敏感丝网印刷电极和基于纳米金颗粒的侧向层析流动条带检测策略，成功实现对CYP2C19*2 GG、GA和AA三种基因型进行分型。该方法可从全血、口腔拭子、唾液和毛发等多个生物样本中实现CYP2C19*2基因分型，并与测序结果具有良好的一致性。由于我们提出的策略仅依赖于热循环仪器和可视化条带检测，该平台的应用将在资源有限区域基因分型方面的应用显示出巨大的潜力。