ERAD抑制剂调节肿瘤细胞凋亡的表观遗传学机制研究

The endoplasmic reticulum‑associated degradation (ERAD) pathway is essential for cancer cell homeostasis. We previously found ERAD inhibitors activated pro-apoptosis gene NOXA via an unanticipated mechanism that integrate ER stress response with an epigenetic mechanism to induce cell death. First, ERAD inhibitors block protein degradation and trigger ER stress. Second，the accumulation of ubiqitinated protein in cells lead to ubiquitn stress. Downregulation of histone ubiquitination relieve its inhibition on NOXA transcription and facilite recruiting transcriptional factor ATF4 to Noxa promoter. In this study, we will further discuss the role of ubiquitinated-H2A.Z on the stability of H2A-H2A.Z heterotypic nucleosomes located in Noxa promoter region . We will also use ChIP–seq to analysis the genome-wide distribution of H2A-H2A.Z heterotypic nucleosomes and investigate how they affect the recruitment of transcriptional factor ATF4 to Noxa promoter region. Finally, with the protein immunoprecipitation and mass spectrometry, we will identifify the cofactors of ubquitinated H2A.Z. These results will establish a novel connection between epigenetic mechanism and cancer cell apoptosis, and it might open a new window for cancer therapy.

内质网相关蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation, ERAD)通路对于维持细胞稳态至关紧要。我们在研究中发现， ERAD抑制剂调节肿瘤细胞凋亡，其机制整合了ERstress 和表观遗传学原理：ERAD抑制剂抑制蛋白降解，引发ERstress, 破坏细胞内泛素平衡，使组蛋白去泛素化，解除其对前凋亡基因Noxa的转录抑制，利于 转录因子ATF4募集到Noxa的转录启动区。本项目拟进一步研究H2A.Z泛素化对Noxa启动区H2A-H2A.Z异型核小体稳定性的调节，利用 ChIP-seq 技术在全基因组范围内检测这个异型核小体的分布及对ATF4募集的影响，并结合免疫共沉淀和蛋白质谱技术寻找泛素化H2A.Z伴侣蛋白和辅助因子。对于ERAD抑制剂调节肿瘤细胞凋亡的表观遗传学机制的深入研究，可为开发新的高效抗肿瘤药物提供理论基础

组蛋白H2A.Z是分布最广的组蛋白变异体之一，通过改变染色质结构参与多种生物过程，如转录调控，基因组稳定性，染色体分离，细胞增殖，异染色质组成与表观遗传记忆调节。H2A.Z是一种促癌的组蛋白变体，在乳腺癌，结肠直肠癌，肝癌和膀胱癌中过表达，但功能和机制还十分不清。本研究通过对GEO和TCGA公共数据的数据挖掘，以及通过对收集的116例肝癌组织和癌旁组织进行全转录组测序和免疫组化检测验证，探讨H2A.Z的两个亚型在肝癌组织和非癌组织中表达情况，并进一步分析H2A.Z的两个亚型表达水平与分期分级、临床预后的相关性，从而揭示H2A.Z通过基因表达调控影响肝癌发生发展的的临床意义。最近的研究发现了许多参与H2A.Z介导的转录调控的分子，但是H2A.Z如何将上游信号转化为多种转录结果仍然未知。组蛋白泛素化修饰是H2A.Z功能调节的基本特征。为了深入H2A.Z调节基因表达的表观遗传学机制，我们构建了野生型的H2A.Z wt和泛素化位点突变的H2A.Z mut逆转录病毒载体，建立相应的稳转细胞株，应用MNase处理染色质并结合蔗糖密度梯度离心法分离得到单核小体，运用免疫共沉淀与western blot首次证明了 H2A-H2A.Z 异型核小体的存在；通过下调Ring2 E3泛素化连接酶、蛋白酶体抑制剂、去泛素化和高盐溶液处理等方法证明了H2A-H2A.Z 异型核小体的稳定性与 H2A.Z 泛素化相关；通过免疫共沉淀和蛋白质谱测序鉴定了H2A.Z泛素化和非泛素化核小体相结合的转录因子和伴侣蛋白；通过染色质免疫共沉淀实验，鉴定了肝癌细胞中泛素化H2A.Z和非泛素化H2A.Z基因定位的不同。本研究对于阐明H2A.Z泛素化的功能和意义具有重要作用，为H2A.Z分子机制的研究提供了新的线索，对于全面了解H2A.Z如何通过激活和维持促进癌症的基因表达程序来促进甚至驱动癌症的发展也至关重要。