基于RANK/RANKL/OPG 通路研究健脾清肠补肾方对溃疡性结肠炎小鼠骨质疏松症的作用机制

Osteoporosis is one of the common complications of ulcerative colitis (UC). Increased secretion of inflammatory cytokines activated RANK/RANKL/OPG signaling pathway, which promotes the differentiation of osteoclast crucially contribute to osteoporosis development in UC patients. Our previous study indicated that Jianpi Qingchang Bushen decoction (JQB) has satisfied therapeutic effect on UC associated OP. This project try to apply the mouse model of chronic colitis related osteoporosis and the co-culture system of two kinds of cells (HT-29 cells /primary mouse osteoclast cells) in vitro , using modern biology research methods, to verify the role of inflammatory cytokines-RANK/RANKL/OPG pathway in the development of osteoporosis in UC, and to study the effect of JQB and possible mechanism based on regulating the RANK/RANKL/OPG pathway. This study will enrich the scientific connotation of TCM therapy of osteoporosis in UC and provide scientific basis for the widespread clinical application of JQB.

骨质疏松症（OP）是溃疡性结肠炎（UC）肠道外常见的并发症。炎症因子分泌增多激活RANK/RANKL/OPG 通路，促进破骨细胞的分化，可能是UC合并OP发生的重要机理之一。健脾清肠补肾方在临床治疗UC合并OP中取得较好疗效。本项目以溃疡性结肠炎小鼠骨质疏松症模型以及HT-29细胞、小鼠原代破骨细胞共培养体系为研究对象，用健脾清肠补肾方进行干预，应用现代生物学技术，论证炎症因子激活RANK/RANKL/OPG通路在UC合并OP发病中的作用，探讨健脾清肠补肾方基于调节RANK/RANKL/OPG通路发挥治疗UC合并OP的作用及机制，为健脾清肠补肾方防治溃疡性结肠炎合并骨质疏松症提供科学依据。

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的消化系统疾病，属炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD）范畴。骨质疏松症是UC肠道外常见的并发症。炎症因子分泌增多激活RANK/RANKL/OPG 通路，促进破骨细胞分化，可能是其发生的重要机理之一。健脾清肠补肾方在临床治疗UC合并骨质疏松症中取得较好疗效。本项目观察了健脾清肠补肾方药物血清对成熟破骨细胞凋亡的影响，在体内实验中探讨了健脾清肠补肾方治疗UC骨质疏松症的潜在药效机制。通过诱导小鼠单核细胞RAW264.7细胞株分化为破骨细胞。制备低、中、高剂量健脾清肠补肾方药物血清（2.5%、5%、10%）。流式细胞术检测破骨细胞凋亡率，Western blot检测破骨细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达。通过吡罗昔康诱导IL-10 基因敲除小鼠构建UC骨质疏松症小鼠模型，同时给予健脾清肠补肾方干预。观察小鼠一般情况，进行结肠组织病理学检测，结肠超微结构观察，腰椎Mirco-CT扫描，RT-PCR和Western blot法检测小鼠结肠组织中相关基因与蛋白表达水平。.成功诱导RAW264.7细胞株分化为破骨细胞。与空白对照组比较，健脾清肠补肾方各剂量组细胞凋亡率均明显升高，破骨细胞Bcl-2蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2/Bax比值明显降低，其中健脾清肠补肾方高剂量组变化最明显。健脾清肠补肾方药物血清可能通过下调Bcl-2和上调Bax蛋白的表达从而促进破骨细胞凋亡。成功复制UC骨质疏松症小鼠模型。模型组小鼠骨量减少，骨小梁松散；BV/TV和BMD均明显降低；健脾清肠补肾方能够改善模型小鼠的一般情况，减少模型小鼠结肠组织中炎性细胞浸润、隐窝脓肿及溃疡形成等病理学改变，下调模型小鼠结肠组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和NF-κB基因表达的水平，改善RANK、RANKL、OPG和NF-κB蛋白水平的升高。健脾清肠补肾方通过降低炎症因子释放，减少结肠黏膜炎症，抑制RANK/RANKL/OPG信号通路活化，进而减少破骨细胞的形成和骨吸收，从而改善骨代谢发挥治疗UC并发骨质疏松症的作用。.本项目探讨了健脾清肠补肾方治疗溃疡性结肠炎合并骨质疏松症的药效机制，丰富中医药在溃疡性结肠炎合并骨质疏松症治疗中的科学内涵，为其临床推广应用提供新的理论依据。