基于钠离子通道的蝎镇痛活性肽镇痛作用机制研究

东亚钳蝎钠离子通道镇痛活性肽是一种宝贵的来源于药用动物的潜在镇痛药物，但其与疼痛相关电压门控钠离子通道亚型间的作用机制尚不清楚。本项目基于已从全蝎分离纯化筛选到并在大肠杆菌实现可溶性表达的、具有镇痛作用的单链Na+通道镇痛活性肽为基础，利用膜片钳技术、激光扫描共聚焦显微术结合分子生物学技术手段，研究蝎镇痛活性肽与疼痛相关电压门控Na+通道亚型Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8 和Nav1.9之间的作用关系,从而阐明以钠离子通道为靶点的蝎镇痛活性肽镇痛作用机制。该研究具有重要的理论意义和实际应用价值：1）阐明我国传统中药钳蝎的有效组分镇痛作用的机制，为进一步临床研究及应用开发奠定重要的理论基础；2）确定蝎镇痛活性肽与钠离子通道作用的方式与机制，为镇痛药物的理性设计及新作用靶点的探寻提供理论依据。并因此指导新药开发，为寻找具有自主知识产权且无成瘾性的高效镇痛药奠定基础。

课题组前期研究发现东亚钳蝎镇痛活性肽具有强大镇痛作用，是一种宝贵的来源于药用动物的潜在镇痛药物，但其镇痛确切机制尚未阐明，有何种已知或未知的通路参与其中，是否存在新的潜在通路，这些难点问题亟待解决。本项目在前期工作基础上，基于已从全蝎分离纯化并在大肠杆菌实现可溶性表达、具有镇痛作用的重组蝎镇痛活性肽为基础，应用膜片钳等多种技术手段研究了重组蝎镇痛活性肽的镇痛作用的离子通道机制。. 研究结果表明，该肽与TTX-R钠离子通道亚型关系密切，蝎镇痛活性肽（3 nM -3 μM）不影响原代培养的大鼠背根神经节神经元的存活率，1 μM能显著抑制大鼠背根神经节神经元Na+ 通道电流的幅度，抑制率为51.4%；进一步分型研究结果表明，蝎镇痛活性肽（10 nM -1 μM）能以浓度依赖的方式抑制背根神经节神经元河豚毒素非敏感型（TTX-R）Na+ 通道电流。大鼠DRG神经元上TTX-R分为Nav1.8和Nav1.9两种亚型，为考察清楚蝎镇痛活性肽对TTX-R的影响确切的钠离子通道亚型，进一步对蝎镇痛活性肽的作用机制进行了研究，结果表明该肽对Nav1.8和Nav1.9两种亚型的抑制率分别为53.62%和32.31%，通道动力学研究结果表明，给予1000 nM 蝎镇痛活性肽前后Nav1.8电流半数激活电压(V1/2)由(-7.88±1.32) mV左移至(-12.64±0.97) mV (n=6)。说明AGAP加快了Nav1.8的激活；对Nav1.9的动力学特征无明显影响。. 考虑到电压门控钙离子通道和疼痛关系密切，本项目考察了蝎镇痛活性肽对钙离子通道的影响。实验结果表明，AGAP可以浓度依赖性的方式抑制DRG神经元HVA型和T型通道钙电流，但不影响动力学特征。. 上述研究提示AGAP的镇痛作用可能是通过调节TTX-R Na+通道和电压门控钙离子通道实现的。其中对TTX-R钠离子通道的影响较明显，说明该肽对钠离子通道的调节是主要镇痛作用机制。该研究阐明了我国传统中药全蝎的有效组分镇痛作用的可能机制，确定了蝎镇痛活性肽与钠离子通道作用的方式与亚型，研究具有重要的理论意义和实际应用价值，为蝎镇痛活性肽临床研究及应用奠定重要的理论基础；为开发镇痛药物提供新理念；对于疼痛防治有重大意义，并因此指导新药开发，为寻找具有自主知识产权且无成瘾性的高效镇痛药奠定基础。