生物选择性代谢和正交反应介导的靶向标记策略：唾液酸糖蛋白定量和肿瘤细胞成像示踪分析

Protein glycolisation is one of the most important ways of post translational protein modification, and glycoproteins play a crucile role during life process. We will design and synthesize a new reporting molecule of multiple functions including ICP-MS readout, MRI and fluorescence imaging.It can be labeled specifically onto the N3-Sia at the end of sugur chain of sialoglycoproteins, which are biometabolized into the sialoglycoproteins,via the so-called bio-orthogonal reaction. This specifc labling enable one not only to quantify and count the sialoglycoproteins and tumor cells on which sialoglycoproteins are overexpressed, but also to be subjected to MRI and fluorescence imaging of the sialoglycoproteins and tumor cells. Besides, because of a biotin unit has been binded into the reporting molecule, the sialoglycoproteins can be enriched and separated out of the proteins bulk. This makes it easy to further characterize the sialoglycoproteins using ESI- and/or MALDI-based mass spectrometry.The bioselective metabolism and bio-orthogonal mediated target-labeling strategy with multiplex detection ability will offer ever more information on the concentration change of the sialoglycoproteins and the translocation of the tumor cells, presenting a new tool for studying the behavor and mechnism of sialoglycoproteins during cancer development.It is very much expected that such information obtained will benefit the design of drugs towards cancer.

蛋白质糖基化是一类重要的蛋白质翻译后修饰方式,糖蛋白在生命过程中发挥着重要作用.我们针对唾液酸糖蛋白,设计合成新靶向多功能信号（质谱、顺磁共振造影和荧光）报告分子，利用叠氮修饰的非天然唾液酸糖苷可通过细胞自身代谢组装到糖链末端的特点,进一步通过生物正交反应将所设计合成的多功能信号报告分子一维靶向标记到肿瘤细胞表面唾液酸糖蛋白上,不仅可实现唾液酸糖蛋白和肿瘤细胞的ICP-MS定量和计数分析，而且可进行肿瘤细胞表面唾液酸糖蛋白和肿瘤细胞的顺磁共振造影和荧光成像；此外，标签分子中集成了生物素单元，可用于唾液酸糖蛋白的富集分离，便于生物质谱进行结构鉴定。这一生物自身代谢和生物正交反应介导的靶向一维标记多维检测方法可以提供唾液酸糖蛋白含量变化和肿瘤细胞转移的示踪信息，为进一步研究肿瘤细胞表面唾液酸化的糖蛋白在肿瘤发生和转移过程中的作用机制提供了新的研究工具，可望为肿瘤治疗药物的设计提供有力的信息。

糖基化翻译后修饰是学术界公认的最重要且最广泛的翻译后修饰之一。细胞糖基化后修饰研究是目前大家关注的研究热点和难点，对解决与人类健康和药物设计相关的科学问题具有极其重要的意义。在国家自然科学基金面上项目“生物选择性代谢和正交反应介导的靶向标记策略：唾液酸糖蛋白定量和肿瘤细胞成像示踪分析(2014-2018)”的支持下，我们瞄准细胞膜蛋白质等生物分子糖基化后修饰的特异性靶向标记和高灵敏度定量问题开展了为期四年的研究。在众多糖基化后修饰类型中，唾液酸由于其独特的九碳糖化学结构和总是处于糖链末端位置的特点，一直以来都是生物学家和化学家关注的“明星分子”。在哺乳动物细胞表面实现唾液酸的靶向光学成像和含量测定是探究疾病发生过程中唾液酸规律性变化的最有效的途径之一。围绕细胞表面唾液酸糖基化后修饰靶向成像和绝对定量这一研究目标，我们发展了靶向代谢组装和专一性的生物正交元素和光学标签的点击标记策略，构建了集电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)定量和荧光成像的分析平台，成功地实现了细胞表面唾液酸翻译后修饰的绝对定量和成像分析，并初步探索了与唾液酸糖基化后修饰有关的一些生物学问题。在特异性代谢组装标记策略和检测灵敏度两个方面都有所发展和显著提升。当使用DBCO-DOTA-Eu对代谢组装到细胞表面的叠氮化唾液酸进行标记后，对唾液酸的检测极限(LOD)达到8.9 fmol；使用DBCO-PEG4-BODIPY (B)时，既可实现细胞表面唾液酸的同位素稀释ICP-MS定量(LOD = 0.24 pmol)又可对细胞表面唾液酸进行荧光共聚焦成像。当针对肝癌细胞表面高度表达的唾液酸进行镧系元素銪标记时，实现了真正意义上的单个肝癌细胞的ICP-MS计数分析。所构建的分析平台使得我们可以评价在抗癌药物紫杉醇的作用下细胞表面唾液酸含量的变化，发现肝癌细胞表面紫杉醇的含量下调67%，而正常细胞表面唾液酸的含量几乎没有变化，预示着紫杉醇对癌细胞的特异性作用机制。所发展的分析方法学进一步推动了基于ICP-MS生物分析的发展，可望拓展至蛋白质及细胞膜表面膜蛋白分子翻译后修饰研究。