酶催化介导的点击标记策略：细菌糖基化末端N-乙酰半乳糖的靶向多维检测

Prokaryotic glycosylation plays a crucial role in the processes of bacterial infection towards their host cells. However, research on bacterial glycosylation is less investigated compared with the more extensive and/or intensive studies on eukaryotic glycosylation, considering either the bacterial species involved or the glycan-glycan structure clarified. Such outcomes are partly because of the intrinsic features of bacteria themselves and, more likely lack of capable analytical techniques and related methods. In this project, we aim to develop an analytical methodology that is capable for study of terminal N-Acetylgalactosamine (GalNAc) in the glycan structure on bacterial cell surface. We plan to design and synthesize a multifunctional labeling molecule that has targeting warhead, report element, fluorophore and bioconcentration moieties, thus based on the specificity of galactose oxidase catalysis and bio-orthogonal click reaction, a multidimensional analytical platform integrating, for example, elemental mass spectrometry, fluorescence imaging and biological mass spectrometry towards the terminal GalNAc can be established. On such a platform, study of the relationship between bacterial infection ability and the content, dynamic distribution of the terminal GalNAc and its linked glycan structure can be performed. It is expectable that the targeted multidimensional measurement platform established in this project will not only provide more information on understanding of GalNAc-mediated pathogenic mechanism of bacteria, but also will leverage the developments of research on other types of bacterial glycosylation, providing basic science support on the design of glycan-based novel antibiotics.

原核细菌糖基化在致病菌侵染宿主细胞过程中扮演着重要角色。但是，相比于真核细胞糖基化系统深入的研究，细菌糖基化的研究尚显不足：不论是涉及的细菌种类还是糖苷单元和它们组成的糖链结构；这主要是因为细菌本身的特点，另一方面，胜任细菌糖基化研究的分析技术和方法有待进一步发展。本项目针对细菌表面糖基化糖链末端N-乙酰半乳糖（GalNAc）开展研究，发展适于细菌糖基化研究的检测方法学；设计集成靶向基团/报告元素/荧光基团/生物富集基团于一体的多功能标签分子，构建基于酶催化介导和点击偶联标记的靶向多维分析平台（元素质谱/荧光成像/生物质谱），研究GalNAc的含量、动态分布和所处糖链结构与致病菌侵染能力之间的关系。可以预期，针对GalNAc建立的靶向多维测量平台将深化对细菌致病机制的理解，也将撬动细菌其他种类糖基化研究的开展，为基于糖苷的抗生素药物的设计提供基础科学支撑。

糖基化是蛋白质执行其生物功能过程中不可或缺的翻译后修饰方式之一，普遍存在于真核细胞和原核细菌中，具有酶介导形成非模板化的复杂糖链结构特征。细菌细胞表面丰富的膜蛋白多为糖基化蛋白，是致病细菌粘附侵染宿主细胞和定植过程的桥梁。但是，在细菌细胞表面发生的糖基化过程非常复杂，糖基化的种类和功能因糖基化糖链的组成和结构不同呈现出多样性。目前，糖基化研究主要集中在哺乳动物细胞的层面，针对原核细菌的研究还尚显不足。究其原因，主要是：(1)已成功应用于真核细胞的非天然单糖代谢组装策略，因细菌酯酶的活性较低，较难应用于细菌糖基化研究；(2)细菌的体积远小于真核细胞，致使细菌的糖基化膜蛋白含量极低，需要发展选择性更好灵敏度更高的检测工具和策略。在国家自然科学基金面上项目“酶催化介导的点击标记策略：细菌糖基化末端N-乙酰半乳糖的靶向多维检测(21874112)”的支持下，我们针对细菌细胞表面糖基化糖链末端半乳糖(Gal)/乙酰半乳糖(GalNAc)糖基化以及Gal/GalNAc介导的细菌-细胞相互作用问题开展了研究。从发展特异性标记分子工具和建立单细胞分析平台开始，利用特异性酶催化和点击化学策略，对细菌细胞表面Gal/GalNAc糖基化进行识别和检测。主要开展的研究工作有：(1)设计合成了具有质谱和光学报告能力、靶向细菌细胞表面Gal/GalNAc和细菌细胞壁肽聚糖结构中D-丙氨酸的分子标签，研究了标签分子的靶向-质谱-光谱特性，实现了Gal/GalNAc分布的荧光成像和质谱定量分析；(2)自主构建了基于微流控芯片的细菌细胞列队分选-电感耦合等离子体质谱单细胞分析平台，实现了细菌细胞表面Gal/GalNAc的质谱定量分析和细菌细胞计数；在此基础上，(3)研究了Gal/GalNAc介导的细菌对宿主细胞的粘附侵染能力；考察了糖基化的改变对细菌侵染宿主细胞能力的影响，理解由宿主细胞表面糖基化介导的细胞-细菌相互作用机制。已在Anal. Chem.和iScience等学术期刊上发表了研究论文12篇，部分研究结果尚在整理中待后续发表；申请发明专利4件，授权2件；参加国内国际学术会议25次，组办学术会议3次。