基于生物正交标记的活病毒示踪及其体内侵染途径研究

Thorough analysis of viral infection process in host bodies is an important foundation for elucidating the pathogenesis of the virus. Although fluorescence labeling provides an important technical means for virological investigation, how to maintain virus activity and catch the dynamic process of viral infection realistically remain enormous challenges. In the program, to reveal viral infection process and invasion mechanism, the virus labeling and tracking technology in live bodies are developed using mild and non-destructive metabolic modification and highly efficient and specific bioorthogonal reaction. The biocompatible sugar and lipid metabolic probes（Neu5Ac-N3/BCN and Cho-N3） carried a reporter group（-N3/-BCN）are synthesized and virus particles with and without envelopes (H5N1p and EV71) are modified with metabolic probe using metabolic engineering of mammalian cell. The virus tracking technology based on in vivo bioorthogonal reaction are developed to label the modified-virus in host bodies with highly efficiency and specificity.Viral infection route in host bodies is real-time dynamic monitored by in vivo imaging technology,and the unknown relations of viral epitopes and the infection behavior of different virulent strains in host bodies are claryfied as well. The expected results of program will provid brand new technical means for studing viral infection process in host bodies, but also offered important theoretical basis to comprehensive analysis of viral pathogenesis.

深入解析病毒在体内的侵染过程是阐明其致病机制的重要基础。尽管荧光标记为病毒学研究提供了重要技术手段，如何保持病毒活性，“高保真”地捕捉病毒在体内的动态侵染过程仍面临重大挑战。本课题将利用温和无损的代谢修饰和高效、特异的活体内生物正交反应，发展针对宿主体内活病毒的荧光标记与示踪技术，旨在揭示病毒在宿主体内的侵染过程和关键机制。拟合成携带报告基团（-N3/-BCN）且生物相容性良好的代谢探针（Neu5Ac-N3/BCN与Cho-N3），以囊膜病毒（H5N1p）与非囊膜病毒（EV71）为模型，发展基于活体内正交反应的荧光标记技术，实现对宿主体内活病毒的特异性无损标记；通过活体成像技术，动态监测病毒在体内的侵染路径, 并阐明不同毒力株在宿主体内侵染行为的差异与病毒关键表位的联系。项目预期成果不但为研究病毒在宿主体内的侵染过程提供全新的技术手段，而且为全面解析病毒致病机制提供理论基础。

荧光标记为阐明病毒体内侵染过程与致病机制供了重要技术手段，但如何保持病毒活性，“高保真”地捕捉病毒在体内的动态侵染行为仍面临重大挑战。本项目以囊膜病毒（H5N1p）与非囊膜病（EV71）等为主要研究对象，针对其侵染过程中的关键事件，通过细胞代谢工程与生物正交化学建立一种普适性的病毒体内原位标记技术，实现病毒捕获与体内动态侵染行为追踪，并在此基础上开发一种基于病毒转导的安全、高效的CAR-T细胞制备技术，主要研究如下：.（1）利用细胞脂类代谢将叠氮-胆碱衍生物（AE-Cho）嵌合至病毒囊膜表面，并通过生物正交反应成功实现病毒的原位荧光标记。结果表明，92.5±4.1%的病毒能被荧光探针捕获，并有效保存病毒侵染活性。活体成像表明靶向荧光探针在肺部迅速捕捉到流感病毒，小鼠肺部的病毒荧光信号在12-24 h内呈现出动态变化过程。该结果表明病毒原位生物正交标记具有高效、无损的优点，为深入解析体内病毒动态侵染机制提供新策略。.（2）利用蛋白生物合成将甲硫氨酸的叠氮衍生物（Aha）修饰至病毒表面，通过原位生物正交标记实时监测EV71病毒动态侵染机制。结果表明，N3-Cy5.5在体内成功捕获EV71病毒，在各脏器中病毒拷贝数与其荧光强度呈正相关，且不影响病毒活性。该技术成功揭示不同毒力株EV71动态扩散和组织趋向，尤其是阐明SC-EV71病毒株神经系统临床症状的主要原因─神经与呼吸系统趋向，这为直观地可视化研究肠道病毒体内侵染机制提供可靠的技术手段。.（3）利用细胞糖代谢构建叠氮修饰的T细胞人工受体，促进聚合物（PEI-DBCO）包裹的病毒与T细胞的相互作用，并成功将病毒基因转导效率提高4倍，降低CAR-T细胞剂量。该T细胞工程改造技术安全、高效地提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，有效清除了体内肿瘤，为临床CAR-T细胞的制备与肿瘤细胞免疫治疗提供新思路。