基于枯草芽孢杆菌Spo0F-Spo0A双组分群体感应系统的维生素K2动态代谢调控

How to construct a dynamic metabolic regulation system with a strong universality, wide application and small impact is a key problem. Quorum sensing circuitry has attracted the attention of researchers because of its advantages such as inducers-free, pathway-independent and little burden to cells. Bacillus subtilis as a typical model industrial microorganism, establishing a dynamic regulation method based on quorum sensing in B. subtilis is of great significance. In this project, the B. subtilis synthesis of vitamin K2 is taken as an example to establish a metabolic regulation method based on Spo0F-Spo0A two component quorum sensing of the spore forming. First, combined with bioinformatics analysis and non-resistance knockout system, Spo0F-Spo0A system, which is regulated only by quorum sensing. Secondly, using error-prone PCR and site-directed mutation technique, we will get a series of activation and repression Spo0F-Spo0A two component dynamic regulatory system through the saturation mutation of Spo0A binding site and change the location and number of Spo0A binding sites on the promoter. Finally, we will use the Spo0F-Spo0A two component system to realize the dynamic regulation of the key genes for vitamin K2 synthesis. Taken together, all the results of this study will enrich the theory and methods of metabolic dynamic regulation and provide new ideas for the subtle regulation of complex metabolic networks.

如何构建应用范围广且对细胞生长影响小的动态代谢调控系统是一个关键难题。群体响应的动态调控具有无需添加诱导剂、不依赖代谢途径，对细胞生长负担小等优点，引起研究者的广泛关注。枯草芽孢杆菌是一种典型的模式工业微生物，建立其群体响应的动态调控方法具有重要意义。本项目以枯草芽孢杆菌合成维生素K2为例，建立基于形成芽孢的Spo0F-Spo0A双组分群体响应的代谢调控方法。首先，结合生物信息学分析和无抗性敲除系统建立仅受群体响应调控的Spo0F-Spo0A系统；其次，利用易错PCR和定点突变技术完成Spo0A结合位点的饱和突变，改变其在启动子上的位置和个数，获得系列激活型与阻遏型Spo0F-Spo0A双组分系统；最后，利用Spo0F-Spo0A双组分系统实现对维生素K2合成关键基因的多水平、多维度的组合动态调控。该研究成果将丰富代谢动态调控的理论和方法，并为复杂代谢网络的精细调控研究提供新思路。

七烯甲萘醌是一类重要的脂溶性维生素，对预防心血管硬化和治疗骨质疏松具有重要作用。如何通过增强MK-7合成途径，并探索限制MK-7产量的因素，获得一株高效合成MK-7的重组菌株是亟待解决的问题。本项目拟以通过构建不同细胞浓度响应阈值的Spo0F-Spo0A双组分群体响应调控系统，并利用该系统进行维生素K2复杂合成网络的全局和动态重构，实现维生素K2的高效合成。.主要研究内容如下：.（1）在B. subtilis 168中使用组成型启动子强化维生素K2合成前体分支酸和异戊二烯焦磷酸的积累；进一步在重组菌株基因组上增加关键基因menA的拷贝数。结果显示，在摇瓶中，维生素K2的产量为75 mg/L，是初始菌株的8.33倍。.（2）通过截短组氨酸激酶KinA的N端并进行组成型表达，使Spo0A能够持续磷酸化；使用简并引物对Spo0A-P结合位点进行突变，筛选获得亲和力更强的结合位点“ATTGACAGGGAA”；随后，通过改变启动子Pspoiia和Pabrb上Spo0A-P结合位点的序列与个数，获得不同表达强度的激活型与阻遏型启动子；最后，分析信号分子Phr60与细胞生长之间的关系，建立细胞密度与启动子强度之间的模型，最终成功构建了Phr60-Rap60-Spo0A群体响应调控系统。.（3）利用群体响应系统调控MK-7合成途径关键基因的表达，首先使用激活型启动子Pspoiia（cs-1,3）表达基因ispH和hepS/T，动态调控合成有毒代谢物的关键基因，使有毒代谢物能够尽快合成七异戊二烯基焦磷酸（HDP）；然后通过阻遏型启动子PabrB（cs-1）原位替换pyk和uppS编码基因的天然启动子，抑制与细胞生长有关的基因，拉动碳流进入目的产物合成途径。摇瓶发酵显示，重组菌株中MK-7的产量达到360 mg/L，产率为51.5 mg/L·gDCW，生产强度为2.5 mg/L·h。并且经过5-L、15-L和3-T生物反应器的发酵验证，MK-7的产量均能达到200 mg/L以上，发酵周期明显缩短。.该研究成果将丰富和发展微生物代谢动态调控的理论和方法，并为复杂代谢网络的动态和精细调控研究提供新思路，在理论和实际应用方面均具有重要价值。