四种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区保护性抗原表位的研究

The mosquito-borne dengue virus is a high pathogenic agent widespreaded in the tropical and sub-tropical regions with no specific treatments or preventive vaccine. The major difficulty in developing dengue vaccine is due to the cross-reactive and non-neutralizing antibodies elicited by the vaccine may increase the risk of severe dengue infection. Recent studies indicated that neutralizing antibodies showed an effective protection only by recognizing epitopes that distributed in a modest number and had a good accessibility on the virion surface, which may also reduce the potential of vaccine-induced antibody dependent enhancement. We propose to use high-affinity protective antibodies to find the critical antigen determinants on the virion, and these potential protective epitopes can be used for development of a novel vaccine that can reduce or avoid the enhancement of dengue infection. 108 monoclonal antibodies against envelope domain III of the four serotypes dengue virus were developed in our previous study. In this proposal, we attempt to screen 10~15 high-affinity and protective antibodies for the identification of the critical amino acid residues of the immunodominant epitopes involved in virus protection. By evaluating the distributions and accessibilities of these epitopes through protein and virus structure prediction, we are supposed to obtain the critical immunodominat epitopes on the virion surface within domain III of dengue virus envelope protein.

由蚊媒传播的登革病毒是亚热带、热带地区广泛流行的高致病性病原体，没有特异的治疗手段和安全有效的疫苗。阻碍疫苗研制的主要问题在于：疫苗诱导产生的无、弱中和活性的交叉抗体,会介导并增强病毒感染，而增加接种人群二次感染登革病毒的风险。研究表明,当识别的位点在病毒表面达到一定数量且易于接近时，中和抗体才具备有效保护性而不产生感染增强作用。因此我们提出：使用针对病毒的高保护性抗体，反向研究其所识别的病毒抗原表位，有望筛选出病毒表面、对中和保护具有重要意义的抗原位点，从而为设计可避免感染增强效应的新型疫苗提供依据。本项目旨在从已制备的具有潜在保护性、识别登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的单抗中，通过中和实验和动物保护实验筛选出高保护性抗体，再利用噬菌体肽库、酵母展示等技术确定与之对应的抗原表位，结合生物信息学手段分析和推测表位在病毒表面的位置和分布，最终获得Ⅲ区蛋白在病毒表面、可用于疫苗设计的关键保护性位点。

本项目旨在从已制备的具有潜在保护性、识别登革病毒包膜蛋白III区（DENV-EDIII）的单抗中，在具有不同登革病毒受体的细胞中，验证抗体的保护性，筛选出能有效阻止病毒攻击的抗体，进而利用噬菌体肽库技术结合生物信息学分析的方法推测和分析抗体所识别的关键性保护位点，从而为疫苗设计提供参考，解决目前常规疫苗中，因疫苗诱导的无、弱中和活性的交叉抗体介导并增强二次登革病毒感染而产生的接种风险。本研究建立了一套筛选抗体保护性的体外试验系统，用以弥补无法开展有效的动物保护性试验的不足，目前已经筛选出三株针对I型DENV-EDIII型特异性单抗：其中两株抗体在体外不同病毒受体的细胞体系中均表现出较高的中和活性，IC50所对应的抗体工作浓度较目前国际公认的4G2抗体低10-30倍，为下一步开发具有治疗作用的抗体奠定了基础；另外一株抗体表现出极高的亲和力，同样也具备一定的治疗潜力，通过生物学分析，定位该位点在EDⅢ蛋白的G strand区域（389-392aa），关键位点需要通过后续实验验证。此外我们还鉴定出一些DENV型特异性和交叉性抗原表位，可为亚单位疫苗的设计提供依据和参考。本研究还建立了一个在同一系统中同时测定登革病毒抗体中和活性和ADE效应的高通量体外试验方法，可为疫苗接种后病人血清中抗体的有效性进行快速安全评估，具有重要的临床意义。