Ubr5在精原干细胞形成中的功能和分子机制研究

Defects in the development and differentiation of spermatogonial stem cells (SSCs) lead to abnormal spermatogenesis, which ultimately causes male infertility or paternal defects; however, the formation and maintenance of SSCs still remains obscure. A variety of ubiquitin enzymes are highly expressed in spermatogonia, indicating that protein modification by ubiquitination plays crucial roles in the spermatogenesis. Therefore, to identify the enzymes and substrates during the development of SSCs will be of great significance. In our previous work, we demonstrated that E3 ligase Ubr5 was required for spermatogenesis, depletion of which caused impaired seminiferous tubule and a failure of pro-spermatogonial to SSC transition. We performed Yeast-Two hybrid screening and found that Ubr5 interacted with the histone variant H3.3. In this proposal, we plan to investigate the function and molecular mechanism of Ubr5 in the formation of SSCs and unravel how ubiquitination regulates the expression of developmental genes in SSCs. This project will not only improve our understanding of germline stem cells but provide new insights into the diagnosis and treatment of human infertility.

精原干细胞的发育和分化异常会导致精子发生缺陷，这是造成男性不育或者父源性出生缺陷的原因之一。然而，我们对精原干细胞发育和分化的认识还十分有限。多种泛素-蛋白酶体系统的基因已证实在精原细胞中高表达，暗示精原细胞中存在大量蛋白的泛素化修饰，因此开展泛素酶在精原干细胞发育和分化中的功能研究具有重要意义。在前期工作中，申请人首次发现在小鼠睾丸中特异性敲除泛素连接酶Ubr5影响生精上皮的发育和精原干细胞的数目，最终造成雄性不育。通过酵母双杂交实验，我们发现Ubr5与组蛋白变体H3.3之间存在相互作用。此项目将在此基础上，详细阐述Ubr5在精原干细胞形成中的功能和分子机制，揭示泛素化修饰对精原干细胞基因表达的调控作用。我们的研究成果不仅加深对蛋白质转录后修饰调控精原干细胞的理解，同时也为男性不育的诊断和治疗提供理论基础和实践指导。

精原干细胞是成体雄性唯一的生殖干细胞。精确调控精原干细胞的维持、自我更新和分化是精子发生的前提。精原干细胞起源于胚胎期产生的前精原细胞，出生后前精原细胞迁移到曲细精管的基底膜上并分化成精原细胞。然而，对于这一过程是如何被启动的，精原干细胞的命运决定又是如何完成的尚不清楚。在本项研究中，我们发现在非梗阻性无精症患者睾丸组织中泛素连接酶UBR5基因的表达水平下降，并利用基因敲除小鼠探究了Ubr5在前精原细胞发育过程中的作用。首先，我们利用特异性抗体检测到Ubr5在小鼠生殖细胞中表达。Ubr5敲除后雄鼠睾丸减小，生殖细胞严重缺失，类似人类无精子症。进一步的研究发现Ubr5缺失导致出生后前精原细胞逐渐丢失，同时前精原细胞的增殖、迁移，精原干细胞的建立，精原细胞的分化均出现缺陷。为了进一步阐释Ubr5在生殖发育过程中的调控机制，我们对出生后3天的小鼠睾丸进行RNA转录组测序分析，发现Ubr5缺失导致精子发生相关基因的广谱性下调，其中包括精原干细胞发育关键的转录因子，如PLZF，SALL4，FOXO1，Etv4等。对精原细胞染色质的开放程度分析（ATAC-seq）也证实了敲除小鼠基因的启动子区域的染色质可及性发生变化，染色质峰的丢失。为了探究Ubr5缺失对前精原细胞分化产生的细胞自主性影响，我们利用10X Genomic单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，发现敲除小鼠生殖细胞发育轨迹的异常，细胞周期被阻滞。综上所述，我们的数据表明Ubr5是前精原细胞发育和精原干细胞形成的重要调控因子。我们的研究不仅有助于了解男性不育的发病原因，对于男性不育症靶向治疗的发展和辅助生殖技术均有一定理论指导及应用价值。