拓扑异构酶I：喜树碱抑制甜菜夜蛾生长的作用靶标？

DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Top)作为细胞生存的必需酶，在生物体内广泛存在，参与DNA的复制、转录、重组、修复等关键的核内过程。抗肿瘤机制表明喜树碱通过与拓扑异构酶 I-DNA二元复合物相结合形成三元复合物，阻滞DNA复制，引起DNA断裂，最终导致细胞死亡。本项目以甜菜夜蛾中肠细胞SpexII为载体，拟开展以下方面的研究:(1)喜树碱对甜菜夜蛾拓扑异构酶I离体活性的影响；(2)喜树碱连续筛选后甜菜夜蛾细胞SpexII对喜树碱敏感性的变化；（3）拓扑异构酶I活性的变化；（4）拓扑异构酶I基因表达的变化；（5）拓扑异构酶 I基因序列的改变。通过以上研究阐明拓扑异构酶 I是否为喜树碱作用昆虫的靶标，揭示喜树碱对昆虫抑制和致死作用的分子机理。该项目的实施将为探索新的农药靶标提供思路，对发掘环境和谐性农药先导化合物具有重要意义。

DNA拓扑异构酶(Topoisomerase,Topo)作为细胞生存的必需酶，在生物体内广泛存在，参与DNA的复制、转录、重组、修复等关键的核内过程。抗肿瘤机制表明喜树碱通过与拓扑异构酶 I-DNA二元复合物相结合形成三元复合物，阻滞DNA复制，引起DNA断裂，最终导致细胞死亡。通过本项目研究我们首次克隆了甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hübner）DNA TopoI 基因全长(GenBank: JN258956)，序列分析表明甜菜夜蛾Topo I中重要活性位点如V420, L530, A653 和T729 （根据人Topo I氨基酸序列编号）没有发生突变，对喜树碱及其衍生物敏感；体外抑制试验表明，喜树碱及羟基喜树碱对甜菜夜蛾Topo I酶解螺旋活性和真核表达的纯酶TOP70均具有抑制性，且具有浓度依赖性；经喜树碱和羟基喜树碱筛选后，随着处理时间的积累，Topo I酶活性逐渐降低，Topo I mRNA表达量上调增加，但没有显著的浓度相关性，TopoI蛋白含量降低。综合上述，喜树碱类化合物作用于昆虫体内TopoI；通过筛选后，细胞内Topo I 活性降低，mRNA表达量增加，导致细胞对喜树碱及其衍生物的敏感性发生改变，并且可能通过引入细胞内高Topo I mRNA表达量和低TopoI酶活性间的矛盾来调节细胞命运的选择。本项目从基因水平、转录水平和酶活性水平上阐明了喜树碱及其衍生物对甜菜夜蛾Topo I靶标的作用方式和机制，从而回答了昆虫Topo I是否为喜树碱及其衍生物的作用靶标这个问题，揭示了喜树碱及其衍生物对昆虫抑制和致死作用的分子机理。该项目的研究结果为探索新的农药靶标提供思路，对发掘环境和谐性农药先导化合物具有重要意义。