喜树碱诱导甜菜夜蛾胱天蛋白酶家族的级联反应

Caspases are the key mediators of apopotosis. The caspase cascade includes a serie of events leading to the activation of initiator and downstream caspases in cells. The greater understanding of caspase-mediated celluar dynamics and transduction mechanisms in apoptosis is important for the investigation of cell death signaling and regulatory networks, and the development of drugs of targeting specific caspases. Using a combination of biochemical assays, fluorescent proteins, and immunoblotting, we will identify and characterize this gene family in Spodoptera exigua Hübner, investigate their likely function in the initiation and execution of insect cell apoptosis, detect the activation of caspases induced by camptothecin and hydroxycamptothecin in Spex-II, and illuminate the networks of the caspase-mediated apoptotic cascades. Results of these will map out the lineage of initiator and effector caspases and their regulation, and how they interact throughout the process from initiation of the first apoptotic signal to the final consequential breakdown of cellular integrity. These studies will provide the new insights to explore environment-friendly pesticides and are important for researches focused on molecular mechanisms of insect cell apoptosis and insect toxicology.

胱天蛋白酶作为细胞凋亡的中枢效应器，在细胞凋亡的启动及进程中发挥着关键的作用。胱天蛋白酶家族成员通过对凋亡信号的募集、传递和执行，完成胱天蛋白酶成员之间的级联反应，推动细胞凋亡进程。本研究围绕喜树碱及衍生物诱导甜菜夜蛾细胞凋亡过程中的胱天蛋白酶级联反应，采用生物化学、分子生物学、免疫学和荧光标记等技术发现和鉴定甜菜夜蛾胱天蛋白酶家族成员；明确其生物化学和生物信息学特性；找出参与喜树碱诱导的甜菜夜蛾细胞凋亡的胱天蛋白酶成员，并测定其在凋亡过程中的作用；揭示甜菜夜蛾细胞凋亡过程中起始和执行胱天蛋白酶之间的级联反应。这对阐明喜树碱及其衍生物的杀虫活性机制以及胱天蛋白酶家族的昆虫毒理学作用具有重要意义，将提高我国植物源活性物质的研发水平，而且对于发现生态安全性特异靶标和环境和谐性农药都具重要的应用价值和探索性。

胱天蛋白酶是存在于多细胞生物中的一类保守的信号蛋，通过蛋白切割作用使靶标获得或者失去功能，在细胞凋亡的启动及进程中发挥着关键的作用。当细胞受到各种因素作用时，起始胱天蛋白酶募集凋亡信号形成活性复合物，切割和启动执行胱天蛋白酶，继而执行胱天蛋白酶对其底物进行蛋白水解，推动细胞凋亡进程，这一伴随着凋亡信号传递的胱天蛋白酶成员之间相互作用的过程即胱天蛋白酶级联反应。本项目以甜菜夜蛾胱天蛋白酶基因家族成员为目标，研究发现甜菜夜蛾胱天蛋白酶基因家族有6个成员，其中caspase-4,5和6为本项目首次获得全长，为填补鳞翅目昆虫及昆虫胱天蛋白酶基因家族成员奠定基础；甜菜夜蛾胱天蛋白酶家族6个成员均参与喜树碱和羟基喜树碱诱导的细胞凋亡过程，其中caspase-4,5,6为起始胱天蛋白酶，caspase-1,2,3为执行胱天蛋白酶；喜树碱诱导的凋亡过程中caspase-1为主要执行胱天蛋白酶，caspase-4和5为起始胱天蛋白酶；羟基喜树碱诱导的凋亡过程中，caspase-2为主要执行胱天蛋白酶，caspase-3和caspase-4为起始胱天蛋白酶。同时，caspase-4和caspase-5基因表达量在喜树碱和羟基喜树碱预处理的早期1h和晚期24h和48h，均有两个峰值，说明作为起始胱天蛋白酶在细胞凋亡级联反应过程中具有一定的影响的作用；在喜树碱和羟基喜树碱诱导甜菜夜蛾细胞凋亡过程中，甜菜夜蛾细胞线粒体膜通透化，细胞色素c释放到细胞质中，与起始胱天蛋白酶4和5形成凋亡体，激活执行胱天蛋白酶1，引发细胞凋亡。该研究结果揭示了甜菜夜蛾细胞凋亡过程中起始和执行胱天蛋白酶之间的级联反应，这对阐明喜树碱及其衍生物的杀虫活性机制以及胱天蛋白酶家族的昆虫毒理学作用具有重要意义，将提高我国植物源活性物质的研发水平，而且对于发现生态安全性特异靶标和环境和谐性农药都具重要的应用价值和探索性。