应用Western Blot筛选ELISA定量分析冬虫夏草中的指标性蛋白质与鉴定研究

Because of the great value and rare of Cordyceps sinensis (Berk) Sacc.,nowday the fake medicine is very much. These infuenced the validity and clinic safety, and the similarity between the true medicine and fake medicine is very close. It is very different to distinguish the medicinal materials using traditional identificated method, much more the process powder cannot distinguished. So the authentication for Cordyceps sinensis (Berk) Sacc.have turned into a study hotspot. In our preliminary studies, We found 26 kinds of indicator protein from Cordyceps. Based on these indiator protein, We designed to filter and optimization 2-3 indicator protein using Western immunoblotting and bioinformatics predicted screening, and further establish the ELISA method to do quantitative analysis of the indicator protein components for Cordyceps.Research utilization Western blot high-resolution, high-specific advantages, combining bioinformatics analysis of the filter to optimize the indicator protein and enzyme-linked immunosorbent high-resolution, good reproducibility, and quantitative analysis to identify sample analysis volume features Cordyceps sinensis. which supply a new method for the authentication of the pharmaceutical origened from animal and seeds.

冬虫夏草由于价值高、产量小，种间相似度高，目前伪品较多，严重影响了药品的有效性与临床安全，且部分伪品与正品种间相似程度高，采用传统鉴别手段难以有效区分，加工品和粉末依靠现有腺苷含量测定等方法更是无法鉴别，目前冬虫夏草的鉴定研究已经成为一个新的研究热点。课题组在前期自然基金研究工作中首次利用双向电泳技术寻找到冬虫夏草特有的26种指标性蛋白质。本项目拟在26种指标性蛋白质中利用蛋白免疫印记和生物信息学预测初筛、生物活性验证优化可用于定量分析、且结构稳定的2-3种指标性蛋白质，进一步建立酶联免疫技术定量分析该指标性蛋白质组分的方法，建立冬虫夏草鉴定的新方法。本研究综合利用了蛋白免疫印记的高分辨、高特异的优点结合生物信息分析筛选优化指标性蛋白质和酶联免疫技术的高分辨率、重现性好、样本分析量大的特点来定量分析鉴定冬虫夏草。为动物药和种子果实类蛋白质含量高的中药材的鉴定与质量评价提供了一条新的方法。

冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. 寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的幼虫尸体及子座的复合体，是我国传统的名贵中药。供需失衡，伪品甚多，现有标准难以解决，冬虫夏草的鉴定研究成为研究热点，亟需新的鉴定方法。.课题组上个自然基金已经证实正品冬虫夏草具有特异的蛋白质，可作为鉴定的备选指标性组分。.蛋白质的定量分析，目前临床上主要采用金标准酶联免疫吸附剂测定（ELISA）间接测定，在中药鉴定领域尚未报道。本研究采用ELISA检测多克隆抗体特异性间接定量指标性蛋白质含量。具有高度敏感性和稳定性的特点，无需进行样品分离提取和抗原纯化等即可进行定性定量分析，操作简单。.本研究采用凝胶扫描法与Bradford法结合定量冬虫夏草及其混伪品蛋白质，以弥补Bradford法不足之处。课题组前期已利用蛋白质严格的种属特异性和组织特异性，与不同品种间在凝胶图谱中具有差异蛋白谱带的特点，采用双向电泳技术（2-DE）分离冬虫夏草蛋白，获得冬虫夏草与伪品电泳图谱，筛选得26个差异蛋白斑点作为冬虫夏草指标性蛋白质，可作为定性鉴别冬虫夏草。本课题在此基础上，采用搭盐桥与不搭盐桥两种方式优化冬虫夏草2-DE实验条件，通过对比分析不同产地冬虫夏草2-DE共有蛋白图谱和伪品蛋白图谱差异，验证得到冬虫夏草及混伪品21个差异蛋白斑点，结合Q-TOF/ LC/MS/MS和数据库搜索对其进行生物功能分析，选取IP4蛋白质点，建立并优化HPLC和PAGE鉴定与制备IP4蛋白质。将IP4蛋白质作为抗原制备多克隆抗体，采用间接ELISA法测定其效价和特异性，达到后续实验要求后建立ELISA方法定量评价冬虫夏草及混伪品中指标性蛋白质IP4新方法，验证结果正品冬虫夏草为阳性反应，伪品冬虫夏草为阴性反应，表明该方法可定性鉴别冬虫夏草；测定结果表明不同产地间IP4含量有所不同，提示IP4可作为ELISA定量评价冬虫夏草质量的关键指标。达到快速鉴别冬虫夏草与混伪品目的并可从定量的角度评价冬虫夏草的预期。