应用凝集素亲和的蛋白质组学技术筛选、鉴定肝癌血清糖链异质性蛋白

糖蛋白糖链变化与恶性肿瘤密切相关。基于我们关于肝癌患者血清可能含有一组糖蛋白产生岩藻糖基化改变的推测，本项目试图筛选、鉴定这些糖蛋白，寻找新的肝癌标志物，建立新的肝癌诊断模式。鉴于小扁豆凝集素可以专一性捕获岩藻糖基化糖蛋白的原理，本项目将应用基于小扁豆凝集素亲和的蛋白质芯片技术和二维电泳技术检测肝癌患者、良性肝病患者和正常人等各种血清标本，通过配套软件采集和分析获得的相关数据，经反复比对和统计处理后，建立肝癌特征性血清糖蛋白指纹图谱模型，同时提取差异蛋白质点进行质谱分析，进一步鉴定特异性波峰和差异蛋白，筛选新的候选肝癌标志物。在此基础上选用合适的实验方法进行大样本的临床检测，并结合血清甲胎蛋白含量和肝癌病理学参数等其它临床资料进行统计学处理分析，验证其灵敏度和特异性，科学评价该血清糖蛋白指纹图谱模型和候选肝癌标志物在肝癌早期诊断和预后预测中的应用价值，为肝癌实验诊断提供一个新的技术手段。

本项目研究内容原有两个部分。在项目实施过程中，根据实际情况，适时增加一个研究内容（后述第三部分）。一、应用基于小扁豆凝集素亲和的双向电泳技术分离肝癌相关血清岩藻糖基化糖蛋白，鉴定出22种血清蛋白质，其岩藻糖基化程度在肝癌组、慢性肝病组和健康人组中有明显差异。分析结果表明在肝癌发生、发展过程中，不同糖蛋白岩藻糖基化异常的表现形式不同，包括逐渐升高和逐渐降低等。这一发现不同于以往文献报道的肝癌血清糖蛋白高度岩藻糖基化的情形。通过Western blot验证了其中岩藻糖基化载脂蛋白H表达在肝癌组、慢性肝病组和健康人组之间有显著差异（P<0.05），且表达量依次逐渐降低，可作为一个潜在的肝癌早期诊断标志物。二、应用基于小扁豆凝集素亲和的CLINPROT系统建立肝癌相关血清岩藻糖基化蛋白质指纹图谱模型。经过盲法检测，该模型能从所有血清标本、慢性肝病和肝硬化中分别检出肝癌的灵敏度和特异性依次为74.07%/76.81%、81.48%/83.72%和88.89%/86.36%。将该系列诊断模型与AFP检测联用，肝癌诊断的灵敏度和特异性依次提高为81.48%/88.41%、88.89%/90.70%和92.59%/95.45%。表明这些诊断模型在肝癌早期诊断中的应用前景。随后，从模型中分离鉴定出两个差异蛋白，分别为Isoform 1 of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor和Thymosin beta-4-like protein 3。三、先将获得的血清岩藻糖基化蛋白用胰酶酶解成多肽，然后建立肝癌相关血清岩藻糖基化肽指纹图谱模型。经过盲法检测，该模型可从所有血清标本、慢性肝病和肝硬化中分别检出肝癌的灵敏度和特异性依次为70.37%/69.57%、77.78%/74.42%和81.48%/81.82%。将该系列诊断模型与AFP检测联用，肝癌诊断的灵敏度和特异性获得显著提高。无论是显著差异峰的数量，还是盲测的结果，酶解后的模型均略差于直接检测建立的模型。但是该模型诊断的高灵敏度和高特异性仍显示其具有临床应用的潜力。总之，本项目的研究内容在国内外均未见类似报道，其研究结果发现了肝癌血清糖蛋白异常岩藻糖基化的新形式，为肝癌的早期诊断和筛查提供了新方法和新途径，并且为进一步鉴定新的肝癌诊断标志物奠定了基础。