患者来源ips细胞在球细胞脑白质营养不良发病机制中的研究

Globoid Cell Leukodystrophy (GLD, Krabbe Disease) is a lysosomal storage disease, resulting from the genetic deficiency of GALC. Krabbe disease patient may have central and peripheral nervous system involved; patients with Krabbe disease typically present with spasticity, irritability and developmental regression during infancy, with about 90% of patients died before age of two. Our previous work identified a Krabbe disease patient presented as vision loss and peripheral neuropathy. However, the underlying mechanisms remain unclear, with no effective treatment available. Previous mouse model study indicated that psychosine accumulation resulting from the absence of GALC, will lead to high level of oxidative stress state. Thus, we propose a hypothesis that with the patient’s fibroblast, we can set up a patient iPSCs derived neuron model for Krabbe disease (KD-iPSCs-Neuron) study; oxidative stress state will be studied with this cell model. This investigation will shed some new light on the molecular mechanism underling the GALC mutation induced Krabbe disease, and also provide a model for development of new drugs targeting the oxidative stress.

球细胞脑白质营养不良（GLD，Krabbe 病）为累及中枢及周围神经系统的溶酶体病，该病由GALC基因突变引起半乳糖脑苷脂酶缺乏所致。婴儿早期起病患者主要表现为精神运动发育迟滞、痉挛性瘫痪，约90%患儿在2岁以前死亡。前期工作中，我们诊断了以视力下降伴周围神经病变为主要表现的晚发型Krabbe病患者。该病分子机制未明。基于小鼠模型研究发现，GALC酶活性下降导致半乳糖鞘氨醇等毒性脂类蓄积，继发的氧化应急可能参与发病。为探索Krabbe病发病机制及潜在的药物治疗靶点，我们留取患者成纤维细胞，拟建立iPSCs细胞系，分化为KD-iPSCs-Neuron细胞疾病模型，检测此神经元细胞的氧化应急相关基因的表达水平，并采用蛋白碳化检测来验证其氧化应激状态。本研究将旨在建立Krabbe病KD-iPSCs-Neuron神经元细胞模型，探索其发病机制及潜在的药物治疗靶点。

球细胞脑白质营养不良，亦称为Krabbe病（Krabbe disease, OMIM：245200），由位于染色体14q31.3的半乳糖脑苷脂酶基因（GALC）突变所致。该病患者可出现中枢及周围神经系统受损。目前尚无有效治疗方法。本研究课题组临床诊断了以视力下降及肢体无力为主诉就诊，相关神经影像学及电生理检查诊断为脑白质病及感觉运动性周围神经病为主要临床表现的中国晚发型Krabbe病患者，其基因测序发现患者携带GLAC基因复合杂合突变（c.1244G>A G415E及c.461C>A P154H），其外周血白细胞半乳糖脑苷脂酶活性显著下降（约为健康人群的7%）。经我院科研伦理委员会审核通过及征得患者及家属知情同意，本研究课题组从患者（KD）及其父亲（健康对照，AF）经微创活检获取的皮肤组织中分离出成纤维细胞并进行培养，采用CytoTune-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），通过干性检测后进一步将其诱导分化为神经元干细胞及神经元细胞。本课题组发现KD患者成纤维细胞重编程的iPSCs分化的神经元细胞（KD-iPSCs-Neuron）细胞系携带有GLAC基因复合杂合突变（G415E及P154H），其半乳糖脑苷脂酶活性较对照组细胞系显著下降，免疫荧光病理检查显示患者来源细胞系神经元突触连接显著少于对照组，且RNA-seq基因表达差异分析显示上述两组细胞系在参与神经系统的发育分化等生物学过程特别是神经元的产生及分化的基因表达上差异显著。本课题组成功于国内领先建立了患者来源的GLD的细胞层面疾病模型，为进一步该病的基因治疗研究奠定了基础。