LNK对多囊卵巢综合征中胰岛素受体与细胞色素P450c17α丝氨酸磷酸化的调控及其机制研究

研究显示多囊卵巢综合征（PCOS）的两个基本病理生理特征-胰岛素抵抗和高雄激素血症-分别与胰岛素受体（IR）和雄激素合成关键酶细胞色素P450c17α的过度丝氨酸磷酸化有关，但其调控因子尚不清楚。我们前期研究提示连接蛋白Lnk可增强IR丝氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号传导，但是Lnk在PCOS胰岛素抵抗发生中的作用尚需明确；同时Lnk是否能够调控P450c17α的丝氨酸磷酸化，并参与高雄激素血症发生也值得探讨。本项目拟首先观察Lnk在PCOS患者中的表达模式，明确其与胰岛素抵抗和高雄激素血症发生的关系；再在Lnk-/-小鼠或体外改变Lnk的表达水平，观察Lnk对靶细胞IR与P450c17α的丝氨酸磷酸化及其相关信号通路和下游生理功能的调控，并通过Lnk突变体的构建鉴定其关键功能区域。研究将为阐明PCOS胰岛素抵抗和高雄激素血症发病的共同分子机制提供科学依据，并为其防治提供新的基因靶点。

研究显示胰岛素抵抗为多囊卵巢综合征（PCOS）的基本病理生理特征，但其调控因子尚不清楚。本研究完成了① Lnk发现LNK分别在PCOS的卵巢组织以及上皮性卵巢肿瘤中的卵巢组织中高表达，认为Lnk可能与PCOS以及上皮性卵巢肿瘤发病有关。进而，②在上皮性卵巢肿瘤细胞株中过度表达LNK，发现Lnk可以抑制上皮性卵巢肿瘤细胞和上皮性卵巢细胞的增殖，且在上皮性卵巢肿瘤细胞的抑制更明显，从而假设Lnk在多囊卵巢综合征中的表达可能存在异常，导致Lnk的作用增强。③另外一方面，我们观察Lnk-/-小鼠的形态组织学变化，发现在卵泡期小鼠中，卵巢组织的形态学无明显变化，而在黄体期卵巢组织中发现，LNK敲除的小鼠卵巢黄体中的血管增多，正常卵巢中闭锁卵泡增多。Lnk-/-小鼠的闭锁的卵泡明显较少的现象也与Lnk抑制卵巢细胞增殖的结果一致、与Lnk-/-中HSCs池增大的现象相符。然而，值得注意的是，在其他时期的卵巢组织中却没有发现这一变化。这提示Lnk还可影响卵巢激素的分泌。在PCOS中，认为除了胰岛素抵抗外，还存在过多的卵泡发育且过早的闭锁，黄体功能可能存在不足、导致流产增加；有理由推测LNK可能参与了PCOS的这些过程。④ 进而，我们检测PCOS患者以及对照组中全血DNA中的Lnk外显子1序列，发现发现Lnk基因中12922位（rs78894077）、PH结构域，等位基因C突变为T，使密码子CCA变为TCA，编码的氨基酸（242位）由脯氨酸变为丝氨酸，突变的杂合子在胰岛素抵抗和非胰岛素抵抗组发生率最高，与是否高雄激素血症无明显关系（；从而，我们推测Lnk可能与胰岛素抵抗有关，与高雄激素血症无明显关系。从而修正了我们的研究方向，集中研究Lnk与胰岛素抵抗的关系。⑤为了观察LNK对细胞增殖的抑制作用是否可以通过增加其自身的表达起作用的，我们往细胞中添加胰岛素，促进细胞增殖，观察LNK的表达变化，没有发现有统计学意义的变化。⑥进一步，我们在过度表达LNK的卵巢肿瘤细胞中，发现LNK可能通过抑制胰岛素信号通路的传递，抑制卵巢上皮细胞的增殖。⑦为了进一步探讨Lnk作用于胰岛素信号通路的机制，免疫共沉淀方法显示Lnk可分别与胰岛素受体和胰岛素受体底物1结合，且与后者更强。免疫荧光实验还显示Lnk主要在细胞浆，与IR在细胞中有结合；显示Lnk可能通过与胰岛素受体底物1结合，作用于胰岛素受体，抑制胰