LNK对胰岛素抵抗相关的PCOS卵泡发育的调控及其机制研究

Previous studies have shown that Insulin resistance (IR) is closely related to follicular development obstacle of polycystic ovary syndrome (PCOS), but the specific effect of IR on granulosa cells in PCOS patients remains unclear. Preliminary data show that LNK inhibits the PI3K/AKT insulin pathway and the proliferation of granulosa cells. The number of atresic follicles is decreased in Lnk knock-out mice. In PCOS patients, the expressions of LNK in granulosa cells is found to be positively correlated with that of FOXO3 and the severity of IR, which are also in positive relationship. Research shows that inhibition of PI3K/AKT/FOXO3 pathway leads to apoptosis of granulosa cells. Therefore, we hypothesize that LNK may induce the apoptosis and related dysfunction of granulosa cells by inhibiting PI3K/AKT/FOXO3 pathway, which results in follicular development disorders. In this study, we plan to clarify the role of LNK on the granulosa cell apoptosis and follicle development via PI3K/AKT-FOXO3 pathway, based on the study of PCOS women and their primary granulosa cells, the over-expression of the wild-type and mutant LNK or RNA interference (SiRNA) LNK plasmids in human granulosa cell line, as well as the PCOS animal models of LNK knockout mice. By using the visualized fluorescence model of medaka folliculogenesis, we will further observe the interaction between oocyte and granulosa cell. To sum up, the project will comprehensively elucidate the regulation of LNK and its mechanism on the follicular development of PCOS and provide the scientific evidence of LNK as a new intervention target of follicular developmental disorder in PCOS women.

前期研究发现PCOS卵泡发育成熟障碍与胰岛素抵抗（IR）程度正相关，但IR对PCOS卵巢颗粒细胞的作用仍存在争议。预实验显示：连接蛋白LNK抑制胰岛素PI3K/AKT信号传导和颗粒细胞增殖，Lnk敲除小鼠卵巢的闭锁卵泡减少；PCOS颗粒细胞中LNK与FOXO3表达水平和IR程度均显著正相关。有研究提示PI3K/AKT-FOXO3通路受抑制可引起颗粒细胞凋亡。由此提出科研假说：LNK可通过负性调控PI3K/AKT/FOXO3，引起颗粒细胞凋亡与功能异常，导致PCOS卵泡发育成熟受阻。本项目拟在细胞、LNK敲除PCOS小鼠和PCOS患者水平，解析LNK对胰岛素PI3K/AKT-FOXO3通路、颗粒细胞凋亡和卵泡发育的影响；结合青鳉鱼卵巢发育可视化模型，观察卵母细胞和颗粒细胞的相互应答，阐明LNK对IR状态下PCOS卵泡发育的作用及机制，为LNK作为干预PCOS卵泡发育受阻的新靶点提供科学依据。

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome, PCOS）是最常见的引起妇女不孕的原因之一，其发生率为 5-12%。PCOS 病人主要的代谢和内分泌紊乱包括血压升高、临床和生化高雄、糖代谢异常、脂代谢异常，远期并发症有 2 型糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等。临床研究报道 50%-70%的 PCOS 病人有不同程度的胰岛素抵抗(IR)，而胰岛素抵抗与高雄激素血症为 PCOS 的两大基本病理生理特征。前期研究及文献显示，卵泡发育障碍程度与胰岛素抵抗程度呈正相关。此外，PCOS 可通过早期卵泡周期募集过多，优势卵泡生长受阻等方式导致排卵障碍。 . Lnk (SH2B3)是一种细胞内连接蛋白，其包含 PH 结构域、 SH2 结构域和潜在的酪氨酸磷酸化位点。 Lnk 参与了细胞内复杂的信号通路的调控，其中包括糖代谢、能量代谢及生殖等。我们前期研究发现，PCOS 伴 IR 患者卵巢 Lnk 表达明显高于对照；进一步研究发现， Lnk 可与胰岛素受体及胰岛素受体底物 1 形成复合物，增加 IRS-1 磷酸化，从而负性调节胰岛素型号通路分子AKT、ERK1/2 等。我们的研究结果显示：PCOS 患者中胰岛素抵抗发生率增加、Glut4 表达降低，颗粒细胞中 LNK 表达与胰岛素抵抗正相关；PCOS 患者中卵子成熟率下降，颗粒细胞凋亡增加；LNK 和卵子成熟度负相关，与颗粒细胞凋亡正相关；PCOS 患者颗粒细胞 FOXO3 升高，且与 LNK 表达和颗粒细胞凋亡率正相关，与卵子成熟率正相关；PCOS 患者和对照组 GC 中性激素代谢和合成关键分子的受体存在差异：PCOS 患者 FSHR、CYP19、AR、AMHR2 表达增加 ；在 KGN 上过表达 LNK 抑制 akt 磷酸化，并使去磷酸化的 FOXO3 在胞核表达增加；敲低 LNK表达后反之；过表达 LNK 增加颗粒细胞的凋亡，并降低 CYP19 和 FSHR 的表达；LNK 敲除的 PCOS 造模小鼠部分恢复动情周期；LNK 敲除的 PCOS 建模小鼠的 GC 细胞中 AR 表达降低、GLUT4 表达增高 。以上结果均表明LNk 通过负性调节胰岛素信号通路， 促进卵巢颗粒细胞凋亡，从而调控卵泡发育成熟，促进胰岛素抵抗的形成。LNK作为干预PCOS肥胖及卵泡发育受阻的新靶点提供依据。