鹰嘴豆NAC转录因子参与应对干旱胁迫的分子机制研究

干旱严重危害农业生产，抗旱基因工程可提高作物的抗旱能力。NAC是植物特有的转录因子，在植物生长发育特别是抗逆生理上发挥着重要作用。但目前人们对其参与抗逆特别是抗旱的分子机制了解甚少。鹰嘴豆是世界第三大豆类作物、新疆特色作物，耐旱，用于发掘抗旱基因潜力巨大。针对国内外有关NAC转录因子参与应对逆境因子胁迫的分子机制缺乏了解的现状，本项目拟在前期研究积累基础上，以2-3个鹰嘴豆NAC转录因子为研究对象，在干旱胁迫下开展：①调控NAC基因应答干旱胁迫的上游蛋白的研究；②NAC蛋白与DNA核心结合序列的研究；③研究与NAC蛋白互作的蛋白；④NAC蛋白调控的下游基因的研究；⑤初步揭示鹰嘴豆NAC参与应对干旱胁迫的调控网络。其结果将有助于我们对植物应对逆境因子胁迫分子机制的了解；为NAC转录因子在抗旱基因工程中的应用构筑基础，并为我国主要作物抗旱育种提供基因源；促进我国广大干旱半干旱地区的开发和利用。

本研究前期克隆了6个鹰嘴豆NAC转录因子基因，命名为CarNAC1～6。这6个基因都具有NAC家族的典型结构，并且都能不同程度的响应逆境胁迫和激素信号的诱导。因此，我们挑选其中的CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2三个基因进行进一步研究，三个基因逆境胁迫和激素处理后的mRNA转录水平分析发现3个鹰嘴豆NAC家族在响应逆境胁迫和激素信号功能上既有协同性又有不同的响应模式。克隆CarNAC4和CarNAC5基因上游的启动子片段，两个启动子中响应逆境和激素信号的元件在数量和分布上都有较大差异，表明CarNAC4和CarNAC5基因能够以不同的模式来响应逆境胁迫和激素信号。通过非放射性EMSA实验证实，经原核表达的CarNAC4和CarNAC5蛋白能够在体外与包含NACRS核心序列的探针特异性结合；采用酵母单杂交技术也证实了CarNAC4和CarNAC5蛋白能够在真核生物酵母体内和NAC蛋白的核心结合序列CGT[A/G]特异性的结合。在拟南芥中过量表达CarNAC4、CarNAC5、CarNAC2基因后，过表达拟南芥种子在干旱和盐胁迫条件下具有更高的发芽速率，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥幼苗经过干旱胁迫和盐胁迫后展现了更高的存活率，并且转基因拟南芥叶片中脯氨酸的含量明显高于野生型拟南芥，而受胁迫产生的丙二醛含量低于野生型，转基因拟南芥离体叶片展现了较低的失水速率。CarNAC4转基因拟南芥在干旱胁迫下，6个逆境相关基因（RD29A，ERD10，COR15A，COR47，KIN1，DREB2A）的表达量在转基因拟南芥内明显高于野生型拟南芥。CarNAC5转基因拟南芥干旱胁迫下，5个逆境相关基因（RD22，RD29A，ERD10，COR15A，DREB2A）的表达量在转基因拟南芥内明显高于野生型拟南芥。CarNAC2转基因拟南芥干旱胁迫后，转基因拟南芥中4个逆境相关基因（COR15A，RD22，RD29A，KIN1）mRNA水平明显高于野生型植株。酵母双杂交系统和双分子荧光互补技术发现CarNAC4蛋白自身以及与CarNAC5之间存在互作，CarNAC4、5蛋白与CarZF2蛋白之间存在互作。同时，建立了鹰嘴豆快繁体系和初步建立了鹰嘴豆遗传转化体系。本研究进一步分析了鹰嘴豆NAC转录因子在逆境下的调控机制，这3个基因在作物逆境基因工程方面展现出较大的应用潜力。