棉花抗黄萎病基因GhSNAC2的功能鉴定及其抗病机制

Verticillium wilt, one of the most devastating diseases for cotton, causes dramatic cotton yield loss and quality reduction in China. Identification and characterization of cotton genes responsive to diverse diseases will pave the way for cotton breeding of disease resistance. Our previous data indicated that the GhSNAC2, a NAC transcription factor, was significantly induced by Verticillium wilt. In this project, we will analyze the spatial and temporal expression profile of GhSNAC2 in various tissues and under Verticillium wilt stress, analyze the expression patterns of GhSNAC2 under exogenous Salicylic acid, jasmonic acid and ethylene stimuli, evaluate the roles of GhSNAC2 responsive to Verticillium wilt by overexpressing and silencing GhSNAC2 in cotton and Arabidopsis, identify the downstream genes of the GhSNAC2 by RNA-seq and yeast one-hybrid analysis. The results of this project will help to elucidate the molecular mechanism of GhSNAC2 resistant to Verticillium wilt.

黄萎病严重影响棉花的产量和品质，是我国棉花的主要病害之一，发掘抗病基因并阐明其抗病机制是开展棉花抗病分子育种的基础。初步分析表明棉花AhSNAC2为NAC类转录因子，黄萎病菌胁迫强烈诱导其表达。本研究拟详细研究GhSNAC2在棉花不同器官组织和黄萎病菌胁迫处理不同时间下的表达变化，明确其时空表达模式；研究GhSNAC2在水杨酸SA、茉莉酸JA和乙烯ET等不同激素处理下的表达变化，探讨其参与的激素信号途径；构建GhSNAC2基因的过量表达载体和病毒诱导的基因沉默（VIGS）载体，转化棉花和拟南芥，研究转基因植株接种黄萎病菌后的发病情况以及棉酚、活性氧含量变化；利用RNA-seq和酵母单杂交技术筛选和验证GhSNAC2转录因子调控的下游基因，从而揭示其抵御黄萎病菌危害的分子机理。

棉花是世界上最重要的天然纤维作物。然而，真菌病害黄萎病严重危害我国棉花生产。本研究前期分离到棉花NAC转录因子GhSNAC2基因，并证明其为核蛋白，且具有转录活性。本项目主要研究GhSNAC2在棉花不同组织和不同逆境胁迫处理下的时空表达情况；研究GhSNAC2在病原相关激素MeJA和SA处理下的表达情况；构建GhSNAC2基因的抑制表达和过表达载体并转化棉花和烟草，通过对转基因植株在不同逆境胁迫处理下的表型变化和生理指标分析，明确GhSNAC2转录因子的功能；利用RNA-seq和酵母双杂交技术分析GhSNAC2调控的下游基因。.我们分析了GhSNAC2转录因子的时空表达特性，结果发现GhSNAC2转录因子在棉花22个组织中皆有表达，且在茎和开花后25点的纤维中高表达；GhSNAC2受干旱、高盐和黄萎病菌处理诱导表达，同时受病原相关激素MeJA和SA诱导表达。进一步分析发现，黄萎病菌侵染2h时，GhSNAC2的表达量最高。我们还构建了棉花GhSNAC2过量表达载体和抑制表达载体，分别获得了过量表达GhSNAC2的烟草纯合体和棉花转基因T2代。在黄萎病菌侵染处理下，过量表达棉花GhSNAC2的转基因烟草叶片的坏死斑减少，抗病能力显著增强；而VIGS沉默GhSNAC2的转基因棉花抗病能力显著下降，表明GhSNAC2在抵御黄萎病危害中发挥正向调控作用；利用RNA-seq技术分析了黄萎病菌侵染后的根系转录组，发现1133个差异表达基因，其中上调表达的有446个，下调表达有687个。功能分析表明，差异表达基因参与能量代谢、信号转导和逆境响应等过程；利用酵母双杂交技术鉴定GhSNAC2的相互作用蛋白，发现2个互作蛋白，其中1个为RING型E3泛素连接酶基因，命名为GhZFRG1，其表达亦受黄萎病菌诱导，也是核蛋白。.本研究结果表明棉花GhSNAC2转录因子受黄萎病菌诱导表达，过量表达GhSNAC2，提高了转基因烟草的抗病能力，RING型E3泛素连接酶基因GhZFRG1与GhSNAC2互作。通过本项目的实施，初步提出了GhSNAC2通过与一个E3泛素连接酶GhZFRG1互作响应黄萎病菌危害的信号途径，为进一步研究E3泛素连接酶在棉花抵御黄萎病危害中的作用奠定了基础。