环丙沙星诱导下大肠杆菌sRNA的表达变化及其在耐药中的作用

Although more and more studies have identified that the post-trancriptional network constituted by bacterial small RNAs (sRNAs) has a vital role in coping with environmental changes and stresses., comparatively less is known about their biological roles and effects on bacterial antimicrobial resistance. With the increasing usage of ciprofloxacin, one of the most widely used fluroquinolones which are often used in both human and animal,the resistant strains have becoming threatening. Most recent findings revealed that fluroquinolones induce a series of biological reactions characterized primarily by oxidative stress response in E. coli. For the purpose of uncovering the sRNA responses induced by ciprofloxacin exposure and their contributions in the resistance, sRNA expression profiles related to ciprofloxacin exposure and resistance would be determined by Solexa sequencing. sRNA changes in ciprofloxacin-resistant and susceptible clinial isolates of E. coli would also be verified. Functions and contributions to ciprofloxacin resistance of the sRNAs would be studied in mutant strains with these sRNA gene deleted and complemented. This study would give a new insight about the mechanisms of bacterial resistance and and a new approch to explore the novel antimicrobial targets and strategy.

近年发现由小的调节性RNA（sRNA）组成的转录后调控网络，是细菌感应环境和生理调节的重要机制之一。但细菌sRNA如何感应抗生素压力及在耐药性产生中的作用，尚不清楚。喹诺酮类药物环丙沙星是人和动物抗感染领域使用频度最高的一类药物，相应的耐药问题十分突出。最新研究表明其作用于细菌可引发氧化应激反应和一系列自主调节等生理生化反应。为揭示在环丙沙星作用下细菌sRNA的变化及其在耐药中的作用，本项目拟通过新一代小RNA高通量测序法，确定大肠杆菌中与环丙沙星诱导和环丙沙星耐药有关的sRNA种类，并进一步在临床分离的大肠杆菌环丙沙星耐药株和敏感株中，验证和筛选有意义的目标sRNA；构建目标sRNA基因缺陷株和基因互补株，研究sRNA在细菌抗生素压力应答和耐药性形成中的作用，为明确细菌耐药的产生机制、药物潜在靶标的发掘、建立耐药菌防治新策略奠定关键的理论基础。

细菌sRNA是一类长度在50 - 500核苷酸左右的非编码RNA，通过与靶mRNA碱基互补配对或调节蛋白活性，在细菌的生理生化过程、环境应答中发挥调节作用。喹诺酮类药物是最常用的抗生素之一，耐药株在临床感染中也非常多见。sRNA在细菌的喹诺酮类耐药中是否发挥作用，目前未知。.本项目通过环丙沙星作用下大肠杆菌的转录组测序、结合生物信息学分析，筛选与环丙沙星耐药相关的候选sRNA。进一步在临床分离的大肠杆菌菌株中，根据细菌耐药水平的差异检测相应sRNA的表达水平，结果发现，耐药水平高的细菌相关sRNA的表达水平也高，耐药水平和所筛选的sRNA表达水平呈正相关。通过环丙沙星诱导细菌发生环丙沙星的耐药突变，也增加了细菌内sRNA的水平，进一步验证了sRNA与环丙沙星耐药的关系。.细菌细胞不可避免地暴露于来自于外界（如UV）以及细胞内有氧代谢所产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS），少量ROS是调控细胞正常生理活动的重要信号分子，高水平ROS则会作用于细胞内蛋白质、核酸等生物大分子的损伤，抗生素可通过促进ROS过度累积的机制杀死细菌。本项目在临床分离株中发现，环丙沙星耐药的大肠杆菌，细胞内ROS含量高于敏感株；环丙沙星诱导的耐药突变株中，ROS水平也增高。通过分子生物学手段提高sRNA的表达水平，增加了细菌对环丙沙星的耐受性，这种耐受性的增加并非通过增加药物的外排和减少药物在细菌内的累积、这种传统的耐药机制所实现。进一步发现高水平的sRNA进可通过抑制细胞内ROS的累积，增加细菌对环丙沙星的耐药性，并调节了三羧酸循环中的有机酸代谢环节。本研究首次在临床分离株和实验室菌株中发现，sRNA能够通过调节氧化压力进而调节细菌耐药，为研究细菌耐药机制、寻找抗菌新的靶点和建立相应的抗菌策略，提出了新思路。