大肠杆菌小RNA-MicA在多粘菌素诱导和耐药中的作用机制研究

Polymyxin resistance in Gram-negative bacteria has becoming a worldwide concerned antimicrobial resistance problem. Small RNA (sRNA) plays an important regulation role in antibiotic response in bacteria. Our studies have demonstrated that the expression of Escherichia coli MicA (a sRNA) significantly increased when induced by polymyxin, and several MicA regulated genes have changed expression. We also find micA mutation in some of clinical isolated polymyxin resistant E. coli. All these results have demonstrated an important function of MicA in polymyxin induce and resistance. But we don’t know the exact mechanism. Based on the previous studies, this project will, 1) Employ high throughput transcriptome and other methods, combined with the reported MicA regulated genes, to explore and demostrate the MicA regulated downstream genes which are related to polymyxin effect; 2) Demonstrate and select the meaningful genes through identify the mutation and expression of the clinical isolated polymyxin resistant E. coli; 3) Construct the mutants and complementation strains of the target genes to figure out the phenotypes and functions, so that we can explain the proper function mechanism of MicA and its regulated genes in polymyxin induce and resistance. Through this study, we will provide the theoretical basis for the mechanism of polymyxin-resistant bacteria and for the exploration of new drug targets.

革兰氏阴性菌对多粘菌素的耐药问题已引起全球关注。小RNA（sRNA）在细菌对抗生素应答中起重要调控作用。我们前期研究发现，多粘菌素诱导下大肠杆菌MicA（一个sRNA）的表达大幅度增加，其调控的下游基因表达改变，且临床分离大肠杆菌耐药株中存在MicA核苷酸区突变，表明MicA在多粘菌素诱导和耐药中起重要作用，但机制不明确。基于前期研究结果，本项目拟：1）利用高通量转录组测序等方法，结合已报道的MicA下游基因，在模式菌中系统阐述与多粘菌素作用相关的MicA下游基因并验证；2）在临床分离多粘菌素耐药株中，检测MicA及其与多粘菌素作用相关下游基因的突变和表达变化，验证和筛选有意义的目标下游基因；3）构建目标基因突变株和回补株，进行表型和功能研究，从而阐明MicA及其调控的下游基因在多粘菌素诱导和耐药中的作用机制。本项目有助于完善临床分离株的多粘菌素耐药产生机制，为药物靶标的发掘提供理论基础。

临床分离大肠埃希菌非mcr介导的多粘菌素耐药，通常由染色体上二元调控系统基因pmrA/pmrB的突变所致。大肠埃希菌染色体基因突变导致的多粘菌素耐药机制有待进一步探索。MicA是一个全局调控的sRNA，前期预实验发现其与多粘菌素耐药的相关性。本项目旨在研究micA基因在大肠埃希菌多粘菌素耐药中的作用：利用高通量转录组测序等方法，在模式菌中研究与多粘菌素耐药相关的MicA下游基因并验证；在临床分离多粘菌素耐药株中，检测MicA及其相关下游基因的突变和表达变化，筛选和验证目标下游基因。.项目主要研究结果如下：1）首先利用生物信息学预测到MicA调控的下游基因，再利用RNA-seq分析大肠埃希菌野生型和ΔmicA 突变株在有或无多粘菌素压力下的转录本，分析差异表达基因，并用荧光定量RT-qPCR验证，最终获得与多粘菌素耐药相关的MicA调控的下游基因。2）项目研究中发现了phoP受micA调控，并进行相应功能解析。3）项目在多粘菌素诱导耐药中发现了EvgA/EvgS双组份调控系统的突变对大肠埃希菌多粘菌素耐药的作用：EvgS突变导致大肠埃希菌对多粘菌素耐药，推测EvgS作为外膜感应蛋白的突变，会导致EvgA持续磷酸化，从而调控EvgA调控的下游基因表达，最终导致多粘菌素耐药。4）项目还从临床中筛选出30株非mcr介导的多粘菌素耐药大肠埃希菌，没有发现其MicA的突变，但发现micA调控的phoPQ基因的突变，及pmrAB基因的突变。本项目发现新的多粘菌素耐药相关基因（evgAS）及其可能的调控机制，为后续进一步深入研究多粘菌素耐药机制奠定基础。