dCas9介导的染色质定点修饰促进胰腺β细胞体外诱导分化

In the mammalian pancreas, insulin-secreting beta cells play an important physiological function in regulating the homeostasis of blood sugar levels, malfunction of which can lead to diabetes. At present, stem cell-induced β-cell production is a promising treatment for diabetes, but the current induction method cannot produce functional β cells efficiently. The deficiency could be due to the lack of knowledge of the precise cell differentiation pathways and underlying regulatory mechanisms during the process of β cell development. In this project, we will analyze the developmental process and chromatin regulation of pancreatic endocrine lineage differentiation. We will use low cell number ChIP-Seq with RNA-Seq approaches to analyze the dynamic chromatin profiles and regulatory mechanisms during endocrine differentiation and maturation process. Furthermore, we will use the dCas9 (nuclease-deficient Cas9) technique to edit the chromatin modifications at the regulatory elements of the key developmental master genes during β cell induction in vitro to promote the production of mature β cells. This project can deepen our understanding of the regulatory mechanisms of pancreatic endocrine cell development, improve the efficiency of stem cell induction, and provide positive guidance for the treatment of diabetes.

哺乳动物的胰腺中，分泌胰岛素的β细胞在调节血糖水平稳态中发挥重要的生理功能，其失调会引发糖尿病。干细胞诱导β细胞产生是极具前景的治疗方案，但目前的诱导方法不能高效的产生具有成熟功能的β细胞。这是由于对β细胞发育过程中精确的细胞分化路径和调控机制的了解并不深入。本项目将解析胰腺内分泌细胞谱系的发育过程和染色质调控机制。我们将利用少量细胞染色质免疫共沉淀和转录组测序的方法，揭示在分化和成熟过程中染色质修饰的动态变化及其调控机制。并进一步在体外β细胞诱导分化过程中，利用dCas9(nuclease-deficient Cas9)技术，对关键的发育调控基因进行特定位点表观遗传修饰的编辑，从而促进成熟β细胞的产生。本项目能够加深我们对胰腺内分泌细胞形成的调控机制的深入理解，并改进当前干细胞诱导效率，最终为体外产生成熟的β细胞和糖尿病的治疗提供积极的指导意义。

由人类胚胎干细胞诱导的胰岛β细胞可用于治疗糖尿病。 然而，由于缺乏对β细胞发育过程中潜在调节机制的了解，当前的诱导方法不能有效地产生功能性较好的β细胞。在小鼠胰腺发育过程中，β细胞由表达Ngn3的内分泌祖细胞产生。这一祖细胞首先经历了从Ngn3低表达（Ngn3-low）向Ngn3高表达（Ngn3-high）的转变，随后分化形成含β细胞在内的各类内分泌细胞，并进一步发育成熟。Ngn3和其下游的NeuroD1是这一过程中关键的两个转录因子，我们推测这两个因子可能在转录组及组蛋白修饰等表观遗传组的动态变化调控中起到了核心作用。为了验证我们的假设，我们利用CUT&RUN这种低背景，高灵敏度的研究蛋白质在基因组结合位点的方法，在小鼠胚胎期胰腺Ngn3-low和Ngn3-high细胞中鉴定出了NGN3和NEUROD1这两个转录因子在全基因组水平上的结合位点，并结合已有的组蛋白修饰和基因表达变化对其调控机制进行详细研究。我们针对Ngn3设计了基于CRISPR Cas9技术的基因敲入小鼠Ngn3-Flag-P2A-EGFP。利用FLAG抗体识别NGN3-FLAG融合蛋白，获得了比直接用NGN3抗体更高质量的CUT&RUN数据。研究发现，NGN3主要结合在增强子区域，通过招募组蛋白乙酰转移酶P300添加H3K27ac修饰使其结合的增强子活化，并激活对应基因的表达。NEUROD1则作用在NGN3下游，继续维持这些位点的活化状态并促进β细胞的定向分化。我们同时设计了一种基于CRISPR Cas9技术的基因敲入小鼠在胰腺发育过程中敲除NeuroD1，发现内分泌祖细胞在祖细胞阶段的停留时间延长，并更多地向非β细胞的路径分化。另外，我们已经构建了体外β细胞诱导体系，可利用dCas9-调控酶介导基因编辑技术，在研究发现的重要增强子和启动子位点对β细胞的诱导进行定向改造，更加高效快速地产生功能成熟的β细胞。