CRISPR/dCas9介导Brachyury/Smad1基因修饰诱导人iPSCs成骨分化的实验研究

Accumulating data have shown that induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into osteoblasts, suggesting that iPSCs are promising seed cells for bone tissue engineering. Effective, directed and safe differentiation of iPSCs into osteoblasts are vital for their application in bone regeneration and repair. recent discoveries have demonstrated that CRISPR/dead Cas9 system is an efficient strategy for generation and validation of knock-in lineage specific genes in human iPSCs.A combination of iPSC technology with genome-editing technology may provide an attractive cell-based strategy to dirrected differentiaton. In this study, we will firstly generate a knock-in human iPSCs for the early mesenchymal lineage key genes of Brachyury and Smad1, which will be confirmed by realtime PCR and DNA sequencing. Human iPSCs with Brachyury and Smad1 will be differentiation into osteobalsts in vitro. Bone formation after implantation of human iPSCs derived MSC-PCL/Hy/TCP conducts with into mice bone defect model will be evaluated by histological, molecular biological methods and microCT. The study will deepen our understanding of the molecular mechanisms of osteogenesis in human iPSCs, and may provide a new approach for bone regeneration and repair.

国内外及我们的研究证实诱导多能干细胞（iPSCs）可向成骨分化，成为骨组织工程理想的种子细胞。有效地定向诱导iPSCs成骨分化是其应用于组织工程骨构建及临床骨修复的关键，但iPSCs成骨分化效率尚未达到临床要求。研究表明CRISPR/Cas9系统能高效将特异性基因导入iPSCs。结合iPSC技术和基因编辑技术成为诱导细胞定向分化的热点。本研究拟采用CRISPR/dCas9技术导入向间充质干细胞（MSCs）定向分化的关键转录因子Brachyury与Smad1基因并上调其表达，获得高效诱导成骨分化的MSCs，体外诱导并评价其成骨分化能力，并将其复合具有良好生物相容及骨诱导性的聚己内酯/透明质酸/磷酸三钙（PCL/Hy/TCP）支架，植入小鼠体内修复骨缺损，通过组织学、影像学及分子生物学检测系统全面评估其成骨效果，探讨基因修复的iPSCs提高成骨分化能力的可行性及机制，为骨再生与修复提供新途径。

自体骨和异体骨移植是骨科处理骨缺损的最佳方法，然而两者都存在诸多不足。如何促进骨愈合成为骨科面临的极具挑战性的难题。近年来研究提示，采用种子细胞复合支架材料构建具有生物活性的组织工程骨移植物不失为一种合适的解决方案。国内外及我们的前期研究均提示iPSCs可诱导向成骨分化，成为骨组织工程理想的种子细胞，但iPSCs成骨分化效率尚未达到临床要求。有效地定向诱导iPSCs成骨分化是iPSCs应用于组织工程骨构建及临床骨修复的关键。本项目采用 CRISPR/dCas9 技术成功构建了CRISPR/dCas9介导Brachyury/Smad1基因修饰诱导人iPSCs 来源的MSC，结果表明特异性向导RNA明显上调了内源性Brachyury基因 （9倍）和Smad1基因的表达（14倍）。通过流式细胞仪分析内源性表达Brachyury和Smad1的iPS-MSC表面抗原表达与正常MSC表达相似，其体外成骨能力明显增强。将iPS-MSC种植于电纺聚己内酯(PCL)支架后，SEM电镜下观察到细胞生长良好。在成骨诱导条件下，茜素红S染色呈强阳性，钙沉积明显增加，OC基因表达也明显上调。在此基础上联合最新的信使RNA技术，在上述组织工程骨预先放入编码BMP2的信使RNA，植入大鼠骨缺损模型，结果显示可以明显修复骨缺损。本项目所取得的成果提高了 iPSCs 成骨分化效率，为骨再生与修复提供新途径。