基于特异性抗体的前列腺癌蛋白质组差异表达分析方法的建立及前列腺癌相关抗原的鉴定

前列腺癌是世界上第六常见癌症，在男性癌症中处于第三位，肿瘤可能迅速进展并导致患者死亡。本项目在前期良好的预实验基础上，拟建立一种基于特异性抗体的前列腺癌蛋白质组差异表达分析法并筛选新的前列腺癌相关抗原。首先利用前列腺癌组织总蛋白免疫新西兰兔并去除与正常前列腺组织反应的抗体，同时制备人前列腺癌逆转录病毒cDNA表达文库并转染NIH3T3细胞，制备细胞蜡块并切片，免疫细胞化学染色后阳性细胞即表达前列腺癌特异性cDNA的细胞，以激光显微切割技术分离，应用单细胞PCR结合引物预扩增技术扩增阳性细胞中插入的前列腺癌特异性cDNA，对PCR产物进行测序，获得全长序列。同时制订备选方案以降低项目风险。将所获分子重组表达并制备单抗，系统研究其在蛋白水平的表达分布规律。本项目的最终目标是筛选出5～10个前列腺癌组织特异的分子，深入了解前列腺癌发生、发展的分子机制并在分子水平上指导前列腺癌的预防、诊断与治疗。

受课题资助3年来，按照项目计划书的内容进行研究并对项目的研究内容进行了一定的拓展。成功建立了基于特异性抗体的前列腺癌蛋白质组差异表达分析方法。实验小结如下：. 1.成功制备了高效价的前列腺癌特异性pAb：收集前列腺癌组织标本提取总蛋白，免疫新西兰兔，免疫血清效价为1：32000。用40份前列腺组织标本总蛋白标记Sepharose 4B制备亲合层析柱以去除正常前列腺反应抗体。免疫组化结果显示，一抗稀释度为1:16000时正常前列腺组织阴性，而前列腺癌组织切片中癌细胞为阳性，间质细胞未见着色。. 2.成功构建前列腺癌cDNA NIH3T3细胞表达文库并进行了免疫细胞化学染色，将特异性pAb做1:1000稀释时，前列腺癌组织cDNA NIH3T3细胞表达文库的细胞切片出现阳性染色，而感染了对照病毒的NIH3T3细胞切片中没有出现阳性细胞。. 3.激光显微切割收集免疫细胞化学染色阳性细胞1521个：将前列腺癌cDNA NIH3T3细胞表达文库的细胞蜡块切片裱于乙烯乙酸乙烯酯薄膜的切片上，免疫细胞化学染色后进行显微切割，共计收集免疫细胞化学染色阳性细胞1521个。. 4.成功进行了单细胞PCR并扩增了498条基因：利用蛋白酶K裂解法提取基因组DNA后应用引物延伸预扩增技术扩增单细胞DNA模板，用扩增的DNA模板加入及载体特异的正向和反向引物进行PCR反应。PCR产物混合后进行高通量测序，共测出192条基因。. 5.检索GeneBank数据库，获得前列腺癌特异性分子全长序列，用上述方法鉴定了39前列腺癌相关抗原，完成了课题的既定目标。. 6.对课题项目计划书的内容进行了适当的拓展.重组表达了其中4种前列腺癌特异分子的蛋白并制备单抗，其中3种单抗可用于免疫组化，均在前列腺癌组织中高表达而在正常前列腺组织中不表达，2种分子定位于细胞膜，1种定位于细胞浆，为深入研究这些分子在前列腺癌的诊断和治疗及发生机制中的作用奠定了坚实的基础。. 7.发表了4篇SCI收录论文： 受本课题资助，共发表了4篇SCI收录论文，单篇最高影响因子为3.73，全文均已上传到国家自然科学基金网站研究成果库中。. 总之，经过全体课题成员历时3年的不懈努力，我们圆满完成了本课完成了本课题的各项预定目标并制备了4种前列腺癌特异分子的单抗，为进一步的研究提供了有种条件。